流式細胞術(shù)應(yīng)用 | PBMC T 細胞受體表征檢測

導讀

在本篇論文中您將了解：

• 如何制備 PBMC 和裂解紅細胞進行流式細胞染色；

• 如何使用 DuraClone 進行 PBMC 中的 T 細胞受體流式分析用 DuraClone 通過流式細胞術(shù)實施；

• 使用 CytoFLEX 流式細胞儀和 DuraClone 識別 TCR 亞群。

實驗簡介

T 細胞在免疫系統(tǒng)的功能和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。成熟 T 細胞可表達 CD3 和 T 細胞受體（TCR）。

它們可以根據(jù)其 TCR 類型進一步分為兩個亞群：αβ T 細胞（T 細胞庫的 95%）和 γδ T 細胞（T 細胞庫的 5%）。經(jīng)過與 MHC I 類分子和 MHC II 類分子的親和力選擇， TCR αβ T 又分化為 CD4 T 細胞或 CD8 T 細胞。

γδ T 細胞的最大亞群可表達 Vδ2 TCR 復合體，而較小的亞群可表達 Vδ1 TCR 復合體。研究發(fā)現(xiàn) TCR γδVδ2 T 細胞和 TCR γδ Vδ1 T 細胞在母胎耐受 1 和同種異體移植耐受 2 中發(fā)揮重要作用。多種 T 細胞亞群的相互作用對于各種正常和病理學研究很重要。

DuraClone IM Pannels 被制備成室溫下穩(wěn)定的干粉狀標準化混合試劑。試劑組合方案是基于 One Study 研究以及多家專業(yè)臨床研究型流式實驗室共同設(shè)計完成的。在這里我們展示了正常人 PBMC 應(yīng)用 DuraClone IM TCR 管在 CytoFLEX 上的檢測結(jié)果。

方法

外周血單核細胞（PBMC）分離

將 10 毫升全血用 1X PBS + 3 ％ FCS 稀釋至 21 mL。 將 6 mL Ficoll（Sigma：Histopaque 1077 目錄號 10771）加入三個 15 mL 錐形小瓶中。通過用 10 mL 移液管以非常陡的角度將 7 mL 稀釋的血液加入到 Ficoll 中。

然后將稀釋的血液緩慢加入覆蓋在 Ficoll 上面。將細胞在 1500 RPM 下離心 30 分鐘。吸出上清液，將樣品合并， 并用 PBS + 5％ FCS 洗滌。將細胞沉淀重新懸浮，使用 ViCell 計數(shù)，然后稀釋至每管的終濃度為 1 x 106 細胞/100 μL，用于染色。

DuraClone 染色步驟

將 100 萬個 PBMC 加入 DuraClone IM TCR 管中，然后渦旋 5 秒。在室溫下在避光孵育 20 分鐘后，用 3 mL PBS 洗滌 PBMC，然后在 400 g 力下離心分離 5 分鐘。將 PBMC 重新懸浮于 250 μL 的 PBS 中，然后在 CytoFLEX 上采集數(shù)據(jù)。

結(jié)果

用 DuraClone IM TCR 管快速進行 TCR 亞群檢測

正常 PBMC 使用 DuraClone IM TCR 管進行染色并在 CytoFLEX 上進行分析，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的 T 細胞亞群檢測。大約 30 分鐘時間， PBMC 便被精確地按照其表型特征劃分為不同亞群。使用 DuraClone IM TCR 管是復雜的染色步驟的可行替代方案。

參考文獻

1. Pregnancy and gamma/delta T cells: taking on the hard questions. Mincheva-Nilsson L. Reprod Biol Endocrinol. 2003 Dec 2; 1:120.Review。

2. Characteristics of Vδ1 (+) and Vδ2 (+) γδ T cell subsets in acute liver allograft rejection. Yu X, Liu Z, Wang Y, Wang H, Zhang M, Sun Y, Su H, Jin L, Wang F, Shi M. Transpl Immunol. 2013 Dec; 29(1- 4):118-22.

注釋

本應(yīng)用說明中所示的結(jié)果均 Beckman Coulter CytoFLEX 流式細胞儀上檢測產(chǎn)生。由于分析儀之間的性能存在差異，作者不能保證使用的其他流式細胞儀具有類似的外觀。

試劑詳細信息

通過 CD45 染色 PBMC 上圈出淋巴細胞群 體（A）。CD3+ 淋巴細胞（B）基 于 TCR γδ 或 TCR αβ 的表達又被分為兩群（C）。在 γδ T 細胞中，根據(jù) Vδ1 和 Vδ2 的表達被分為兩個亞群（D）。在 αβ T 細胞中，根據(jù) CD8 和 CD4 的表達分為兩個亞群（E）。

作者：Michael McPherson, Karen Carr, Si-Han Hai .

附屬機構(gòu)：貝克曼庫爾特