光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching FRAP)

研究膜流動性的一種方法。首先用熒光物質(zhì)標(biāo)記膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射細(xì)胞表面某一區(qū)域, 使被照射區(qū)域的熒光淬滅變暗形成一個漂白斑。由于膜的流動性,漂白斑周圍的熒光物質(zhì)隨著膜蛋白或膜脂的流動逐漸將漂白斑覆蓋，使淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加, 最后恢復(fù)到與周圍的熒光光強(qiáng)度相等。

細(xì)胞膜蛋白的標(biāo)記方法有很多種。可以用非特異性的染料,如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)將細(xì)胞膜蛋白全部進(jìn)行標(biāo)記。也可用特異性的探針,如熒光抗體,標(biāo)記特異的膜蛋白。膜蛋白一旦被標(biāo)記就可用激光束進(jìn)行局部照射處理,使熒光脫色,形成直徑約為1μm的白斑。若是可移動的膜蛋白,則會因蛋白的移動,使白斑消失,若是不能移動的蛋白.則白斑不會消失。

根據(jù)熒光恢復(fù)的速度, 可推算膜脂的擴(kuò)散速度為每秒鐘為幾個微米，而膜蛋白的擴(kuò)散速度變化幅度較大，少數(shù)膜蛋白的擴(kuò)散速度可達(dá)到膜脂的速度，大多數(shù)蛋白的擴(kuò)散速度都比膜脂慢，還有一些膜蛋白完全限于某一個區(qū)域。正是這種限制，使膜形成一些特定的膜微區(qū)(membrane domain),這些微區(qū)具有不同的蛋白組成和功能。這實際上是膜蛋白不對稱分布帶來膜功能的不對稱。

FRAP技術(shù)也有它的不足之處。第一,它只能檢測膜蛋白的群體移動,而不能觀察單個蛋白的移動。其次,它不能證明膜蛋白在移動時是否受局部條件的限制。為了克服這些不足,發(fā)展了單顆粒示綜(single-particle tracking,SPT)技術(shù),可以用抗體金(直徑15～40 nm)來標(biāo)記單個膜蛋白,然后通過計算機(jī)控制的攝像顯微鏡進(jìn)行觀察。

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