神經細胞培養大全

體外神經細胞的培養已成為神經生物學研究中十分有用的技術手段。

神經細胞培養的主要優點是:

(1)分散培養的神經細胞在體外生長成熟后,能保持結構和功能上的某些特點, 而且長期培養能形成髓鞘和建立突觸聯系,這就提供了體內生長過程在體外重現的機會。

(2)能在較長時間內直接觀察活細胞的生長、分化、形態和功能變化,便于使用各種不同的技術方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡 、激光共聚焦顯微鏡、同位素標記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進行研究。

(3)易于施行物理(如缺血、缺氧)、化學和生物因子(如神經營養因子)等實驗條件, 觀察條件變更對神經細胞的直接或間接作用。

(4)便于從細胞和分子水平探討某些神經疾病的發病機制，藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經細胞在生長、發育和分化等各方面的影響。 我們實驗室從80年代始開展了神經細胞的體外培養工作，取得了一些經驗，現將培養細胞分類及方法簡要介紹如下:

一、雞胚背根神經節組織塊培養

主要用于神經生長因子(NGF)等神經營養因子的生物活性測定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經突起的生長長度和密度為指標半定量評估NGF的活性。

1、材料和方法

(1)選正常受精的雞蛋，置于37℃生化培養箱內孵化，每日翻動雞蛋一次。

(2)取孵化8-12 d 的雞蛋, 用70% 酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。

(3)用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內，除去頭部后，腹側向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內臟器官。

(4)在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側排列的背根節(圖1)，用一對5號微解剖鑷小心取出。

(5)置背根節于解剖溶液內，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養瓶中，在DMEM 無血清培養液中培養。

2、結果

雞胚背根神經節在含神經生長因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的無血清培養液中培養24 h,神經節長出密集的神經突起。而未加NGF的神經節培養24 h, 未見神經突起生長。

二、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經節分散細胞培養

背根神經節(DRG)細胞起源于神經嵴，NGF研究先驅Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發育并形成廣泛的神經網絡。在體外，分離培養的神經節在NGF存在的情況下，神經突起的生長在一天之內可長達數毫米，因此，利用培養的DRG細胞，進行軸突生長發育的研究，是最為經典而常用的方法之一。

1、材料和方法

取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側水平剪除腹側一半椎骨,暴露脊髓和神經節,用解剖鑷分離出神經節。雞胚背根神經節的取材方法同前。 剝除神經節被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標本于36℃、10%CO2培養箱中培養。24h后傾去培養皿內種植培養液，改用飼養(Feeding)培養液培養。接種第3d, 在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養培養液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養培養液。

2、培養液成份

種植培養液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清; 10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養培養液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,);5 % 馬血清; NGF 20ng/ml;神經營養素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生大鼠背根節神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠背根節神經元接種后4h,大部分細胞可貼壁, 呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現一圈光暈。神經元的細胞核位于中央或偏于胞體一側,核仁明顯,亦可見雙核神經元。接種后24h, 大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數為具有多個突起的多極神經元,少數為雙極和假單極神經元, 突起細長,并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經元外,還常見到幾個或多個神經元聚集在一起, 它們向四周發出樹枝狀的神經突起。 培養2-3d后神經元的突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的神經網絡。隨著培養時間的延長, 神經元突起的主干和分枝明顯延長并增粗,神經突起網絡變得更加稠密, 神經元胞體逐漸增大。大鼠背根節神經元可維持培養2個月。

4、新生小鼠背根節神經元的生長分化和形態特征

新生小鼠背根節神經元的形態結構和生長分化基本上與新生大鼠相似,但小鼠背根節神經元的胞體較大鼠稍小。 神經元亦隨著培養時間的延長而逐漸增大。小鼠背根節神經元亦可維持培養2個月。

5、雞胚背根節神經元的生長分化和形態特征

雞胚背根節神經元的生長分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節神經元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節培養神經元相比,神經突起分枝較少。神經元胞體稍小,神經元亦隨著培養時間的延長而逐漸增大。雞胚背根節神經元亦可維持培養2個月。

三、新生小鼠頸上交感神經元分散細胞培養

交感神經系統在維持機體的正常功能和對環境的適應性反應中起著十分重要的作用。交感神經細胞培養特別有助于神經細胞發育和可塑性研究，利用體外培養系統可進行交感神經細胞的發生、死亡、形態和生化發育、遞質表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過體外培養系統可獲得關于神經營養因子、激素，細胞因子等調節交感神經元發育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的聯系的機制。

1、材料和方法

實驗用出生當天的昆明種小鼠，在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側的頸總動脈,并以此為標志,在頸總動脈分為頸內外動脈交叉處找到上頸交感節, 取出上頸交感節, 置于含 1 % 膠元酶(Collagenase)和1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用種植(Plating)培養液稀釋成0.2×105個細胞/ml密度的的細胞懸液;接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質細胞為背景的35mm塑料培養皿中，每皿2ml細胞懸液置。

置標本于36℃、10%CO2培養箱中培養。24h后傾去培養皿內種植培養液,改用飼養(Feeding)培養液培養。接種第3d, 在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更換新鮮飼養培養液,以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養培養液。

2、培養液成份

種植培養液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清;10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養培養液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,);5%馬血清; NGF 20 ng/ml;神經營養素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生小鼠交感節神經元的生長分化和形態特征

新生小鼠交感節神經元在含 NGF 的培養液中種植后4h, 細胞即開始貼附在膠元薄膜或在皮層膠質細胞層上生長, 交感神經元的胞體一般為圓形, 有時亦可見橢圓或梭形,體積較大, 直徑約8-14μm左右,胞體周圍呈現一圈光暈,神經元的細胞核大多偏于胞體一側,核仁明顯,亦可見雙核神經元 。接種后24h, 大部分貼壁神經元開始長出突起。培養2-3天后,神經元突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的網絡。隨著培養時間的延長, 神經突起網絡變得更加稠密。神經細胞的主干和分枝明顯延長并增粗, 神經元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經元可維持培養1-2個月。

四、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經元培養

中樞神經系統包括腦和脊髓，脊髓是中樞的初級部分，其功能有二，一是傳導感覺和運動沖動，二是完成軀體運動的基本反射。脊髓突然被橫斷并與高級中級失去聯系后產生脊休克。因此，利用體外培養的脊髓腹角運動神經元進行脊髓損傷和修復的研究日益受到重視。

1、材料和方法

用12-14d 胚齡的小鼠、12-14d 胚齡的大鼠、 孵化10 d 的雞胚，在無菌條件下取出胎鼠或雞胚脊髓，剝除脊膜后,將整個脊髓腹側面朝上置于平皿中，用微解剖鑷和雙面刀片沿脊髓中央管縱切兩半，再將脊髓兩側的腹側部分切下，將組織塊切碎， 用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后,用種植培養液(同第二節)稀釋成5×105個細胞/ml密度的細胞懸液,接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培養箱中培養,24h后傾去培養皿內種植培養液, 改用飼養培養液(同第二節)進行培養。以后每周換液兩次,每次更換50%的新鮮飼養培養液。

2、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經元的生長分化和形態特征

胚鼠和雞胚脊髓腹側神經元培養12h后,大部分神經元可貼壁,貼壁神經元呈圓形,直徑5-8μm,其中少數神經元開始伸出1-2個突起。培養24h后, 神經元突起逐漸增多并延長,形成稀疏的網絡,培養的脊髓神經元以雙極和多極為多見, 神經元呈圓形或橢圓形及多邊形不等,胞核清楚,多數具1-2個核仁。隨著培養時間延長, 神經元突起進一步增多、增粗并延長,形成稀疏的神經網絡, 神經元胞體逐漸增大。

多極胞體大的神經元逐漸增多,經膽堿乙酰轉移酶(ChAT)免疫組織化學染色和乙酰膽堿酯酶(AChE)組化染色呈陽性反應。此后，只要定期換液并適當抑制非神經細胞的過度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和雞胚脊髓腹側運動神經元在體外可維持培養2個月。

五、新生大鼠海馬神經元分散培養

海馬屬大腦邊緣系統，與情緒、學習及記憶有關，它具有明顯的長突觸傳遞的長時間程長時程增強(LTP)和長時程抑制(LDT)的能力。LTP和LDP具有協動性、特異性、長時性的特點，目前已被認為是學習和記憶的基礎。而且海馬組織常常是引起癲癇發作的病變部位，并且海馬細胞對缺血、缺氧特別敏感。這些特征反映了海馬神經元的內在性。例如，對缺氧的可塑性和易感性均與NMDA(N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸)受體的獨特性質相關。

海馬具有中樞神經系統的典型特性，有相對同源性的神經元群體，據估計，海馬主要的細胞類型---錐體神經元占海馬全部神經元的85%-90%。海馬CA1和CA2區含有的錐體細胞在電生理特性及其相互連接的形式上各不相同，并能分別進行培養。海馬錐體細胞具有特征性的形態，它們有單根軸突和數根樹突組成，所有的樹突都高度分化并密布樹突嵴。此外，海馬錐體神經元相互之間與中間神經元群體之間均有直接聯系，在體外培養系統缺乏外源性傳入纖維的情況下，海馬神經元相互間仍然能產生廣泛的突觸聯系。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側海馬，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后,用種植培養液(同第二節)稀釋成5×105個細胞/ml密度的細胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養皿中,每皿2ml,置標本于36℃,含10%CO2的培養箱內培養。24 h后頃去培養皿內種植培養液,改用飼養培養液(同第二節)培養。接種第5 d,在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5'-氟- 2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經細胞的過度增殖, 作用48h 后更換新鮮培養液,以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養液。

2、新生大鼠海馬神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠海馬神經元種植后12h,大部分細胞可貼壁,呈圓形, 其中少數神經細胞開始伸出1-2個突起。培養24h后,伸出突起的神經細胞逐漸增多, 突起一般為20-40μm,長者可達60μm。培養3d后, 神經元突起進一步增多并延長,形成稀疏的網絡。培養的海馬細胞以錐體細胞為多見,胞體較大,直徑6-12μm。隨著培養時間的延長,神經元胞體逐漸增大,胞突主干和分技明顯延長并增粗,形成更加稠密的網絡。海馬神經元在體外可維持培養2個月。

六、新生大鼠隔神經元分散培養

隔亦屬大腦邊緣系統，主要與一系例內臟活動、軀體活動，情緒活動有密切關系。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側隔區，培養方法同海馬神經元培養。

2、新生大鼠隔神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠隔區培養神經元的生長分化基本上與新生大鼠海馬神經元相似。但隔神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元,神經元胞體呈橢圓形, 直徑6-8μm。隨著培養時間的延長,神經元胞體逐漸增大,神經突起逐漸增粗, 并互相聯絡成網。新生大鼠隔神經元亦可持續培養2個月。

七、新生大鼠下丘腦神經元分散培養

下丘腦，作為神經系統和內分泌系統的連接點，在神經內分泌研究中有很重要的地位。它不僅通過神經-神經，神經—體液通路與垂體發生直接的聯系，以興奮與抑制兩種不同的機制維持垂體內分泌的相對恒定，而且與腦干網狀結構、皮質邊緣系統等共同調節機體的各種活動。下丘腦的分泌功能以及其所分泌的各種肽類激素、神經多肽是下丘腦參與調節內臟活動、生理機能以及垂體內分泌的重要物質基礎。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側下丘腦，培養方法同海馬神經元培養。

2、新生大鼠下丘腦神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠下丘腦神經元的生長分化和形態特征基本上和新生大鼠隔神經元相似。培養的下丘腦神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元,神經元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm,偶見胞體較大(直徑9-12μm)的多極神經細胞。隨著培養時間的延長, 下丘腦神經元胞體逐漸增大。下丘腦神經元亦可維持培養2個月。

八、新生大鼠大腦皮層神經元分散培養

大腦皮質是大腦半球最外表的一層灰質，大腦皮質內神經元的數量極大，其類型也很多，但均屬多極神經元，神經元之間具有復雜的聯系，反映皮質的高度發展。有人從機能上將皮質分為：感覺皮質、聯絡皮質、運動皮質。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側皮層，培養方法同海馬神經元培養。

2、新生大鼠大腦皮層神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠皮層元的生長分化和形態特征基本上和新生大鼠海馬神經元相似。培養的皮層神經元中既可見到體積較大(直徑8-12μm)的錐體細胞和顆粒細胞(如星狀細胞、籃狀細胞和梭形細胞),也可見到馬提諾蒂細胞,胞體較小,呈三角形或多角形。隨著培養時間的延長, 神經元胞體逐漸增大,突起增粗。新生大鼠皮層神經元亦可持續培養2個月。

九、新生大鼠紋狀體神經元培養

位于大腦皮質下，緊靠丘腦背外側的幾塊灰質，稱為基底神經節，它們包括尾狀核、殼核和蒼白球，前兩者合起來又稱為紋狀體。紋狀體是中樞神經系統的高級部位，在這里進行著運動機能的最高級整合，它們與隨意運動的穩定、肌緊張和軀體運動的整合有密切關系。中腦黑質除含有較多的多巴胺(DA)神經元外，還含有γ-氨基丁酸(GABA)神經元等，紋狀體是其主要的靶組織，共同組成黑質紋狀體DA系統。

十、新生大鼠中腦黑質神經元培養

黑質由中腦背側的致密部和腹側的網狀部組成，中腦黑質是多巴胺神經元存在的部位，實驗表明，大鼠中腦腹側多巴胺在運動和行為中起著關鍵性的作用。黑質多巴胺能神經元退性病變可引起帕金森綜合癥。因此，多巴胺神經元的體外培養為多巴胺神經元的形態、受體分布、藥物作用、電生理特性的研究以及多巴胺神經元移植研究提供了較好的實驗手段。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側黑質，培養方法同海馬神經元培養。

2、新生大鼠中腦黑質神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠中腦黑質神經元的生長分化和形態特征基本上和新生大鼠下丘腦神經元相似。培養的中腦黑質神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元,神經元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm，隨著培養時間的延長, 中腦黑質神經元胞體逐漸增大。中腦黑質神經元亦可維持培養2個月。

十一、新生大鼠小腦神經神經元培養

小腦由外層的灰質(皮質)、內部的白質和三對深部的核團(頂核、間位核和齒狀核)組成。與大腦皮質相比，小腦皮質的結構和神經元環路的組成相對簡單，整個小腦皮質共有三層結構：分子層、浦肯野細胞層和顆粒層。其中含有五種神經元，即顆粒細胞，浦肯野細胞、籃狀細胞、星形細胞和高爾基細胞。

小腦是中樞神經系統中最大的運動機構，主要作用是維持軀體平衡，調節肌肉張力和協調隨意運動。小腦的另一個與運動有關的重要功能是在技巧性運動的獲得和建立過程中發揮運動學習的作用。在體外培養系統中，小腦細胞大小和形態的特征明顯，容易識別。另外，小腦缺陷神經突變的小鼠種系比較多，這些條件都使小腦細胞成為發育研究的良好對象。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側小腦，培養方法同海馬神經元培養。

2、新生大鼠小腦神經細胞的生長分化和形態特征

新生大鼠小腦神經元的生長分化基本和新生大鼠皮層神經元相似。培養的小腦神經元以顆粒細胞為多見,體積較小,直徑3-5μm,亦可見到一定數量的星狀細胞,哺肯野細胞和籃狀細胞(胞體直徑6-8μm),它們均隨著培養時間的延長,神經元胞體逐漸增大,突起逐漸增粗。新生大鼠小腦神經元亦可持續培養2個月。

十二、新生大鼠腦腺垂體細胞培養

大鼠的垂體分為前、中、后三葉，前葉亦稱腺垂體，主要分泌生長激素、催乳素、各種促激素及黑素細胞刺激素。因此建立體外培養腺垂體細胞的方法，可用來探討各種因素直接對細胞分泌功能的影響，以及開展神經內分泌分子生物學的研究。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下分離出腺垂體，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后,用種植培養液(同第二節)稀釋成2×106個細胞/ml密度的細胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養皿中,每皿2ml,置標本于36℃,含10%CO2的培養箱內培養。24 h后頃去培養皿內種植培養液,改用飼養培養液(同第二節)培養。以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養液。

2、新生大鼠腦腺垂體細胞的生長形態特征

接種后24h,新生大鼠腦腺垂體分散細胞即開始貼附在膠元薄膜上生長,腦腺垂體細胞最初分散或聚集成小團,隨后迅速分裂增殖。細胞境界清楚, 形狀不規則,有圓形,卵圓或多角形。核位于胞體中央或偏于胞體一側,可見1-2個核仁。隨著培養時間的延長,腦腺垂體細胞胞體逐漸增大,形成單層, 鋪滿皿壁底層。腦腺垂體細胞可持續培養1個月。

十三、神經膠質細胞培養

(一)雪旺細胞

雪旺細胞(Schwann cell，SC)是外周神經系統最主要的膠質細胞，也是外周神經的成髓鞘細胞;它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細胞的功能極其活躍，一旦神經受損，它能反應性分裂增殖，分泌神經營養因子，產生細胞外基質和細胞粘附分子，對神經元及其軸突起營養和修復作用。近年來的研究表明，雪旺細胞也能促進中樞神經對脫髓鞘損傷的修復，如對脊髓的再生，對視網膜神經節以及對隔-海馬通路再生等。說明雪旺細胞也能改善中樞神經再生的微環境，因而近年來對雪旺細胞的研究，尤其是體外培養研究已成熱點。

1、材料和方法

雪旺細胞培養取材于各類哺乳動物的外周神經和背根神經節，取孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產的人胎兒，在無菌條件下用解剖鑷分離出神經節，剝除神經節被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺)吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養瓶中，于培養箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養皿中, 種植密度為0.2×105 個細胞/ml，每皿2ml細胞懸液置。置36℃、10%CO2培養箱中培養。

接種第3 d, 在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進一步去除成纖維細胞, 作用48小時后更換新鮮培養液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養培養液。

2、雪旺細胞的生長和形態特征

培養15d后可獲得較高純度的雪旺細胞，雪旺細胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經S-100免疫組織化學染色呈陽性反應。增殖分裂的雪旺細胞可用于進一步傳代培養，也可進行冷凍保存備用。

(二)星形膠質細胞

星形膠質細胞是膠質細胞中體積最大，數量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質稀少，星形膠質細胞分兩類，一類為原漿性星形膠質細胞(protoplasmic astrocyte)，其突起短粗，分枝多。另一種為纖維性星形膠質細胞(fibrous astrocyte)，它的突起細長，分枝少。纖維性星形膠質細胞是與少突膠質細胞源自同一前體細胞。星形膠質細胞具有多種功能，中樞神經系統內神經元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質細胞充填，起結構的支持作用，星形膠質細胞的突起構成血腦屏障，星形膠質細胞能攝取和代謝某些神經遞質如γ-氨基丁酸等。

調節局部神經遞質的濃度，使神經網絡能平穩地發揮作用。還能吸收細胞間隙中過多的K+，為K+的存儲庫，通過調節K+的水平而影響神經元的電生理活動。星形膠質細胞能合成和分泌大量神經營養因子，有維持神經元生存和促進神經元突起生長的作用，亦能分泌白細胞介素，腫瘤壞死因子和干擾素等多種細胞因子，星形膠質細胞有分裂能力，在中樞神經系統損傷后，星形膠質細胞增生、肥大，填補缺損，形成膠質瘢痕。

(1)方法和結果

選擇出生 2 d 的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺)吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養瓶中，于培養箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養瓶中, 種植密度為1×105 個細胞/cm2，每瓶10ml細胞懸液置。

置36℃、10%CO2培養箱中培養。每周換液2 次，培養10-14h，細胞分為兩層，下一層為I型膠質細胞即原漿形膠質細胞，上一層是O-2A前體細胞，根據兩類細胞貼壁能力的差異，以振蕩培養技術進行分選，在37℃搖床上振蕩，16 h(180r/min)O-2A前體細胞可被搖下來，搖下來的細胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養瓶中，培養液使用20 % 胎牛血清促進O-2A前體細胞分化為II型膠質細胞即纖維型膠質細胞。可分裂增殖的原漿形膠質細胞和纖維型膠質細胞可用于進一步傳代培養，也可進行冷凍保存備用。純度鑒定可用膠質纖維酸性蛋白抗體(GFAP)染色確定。

(三)少突膠質細胞

1、方法和結果

少突膠質細胞培養方法同星形膠質細胞培養。少突膠質細胞比星形膠質細胞小，光鏡下少突膠質細胞胞體呈圓形或多角形，突起呈串珠狀，根據其所在部位的不同可分為束間少突膠質細胞、神經元周圍少突膠質細胞。在中樞神經系統內，少突膠質細胞主要形成及維持髓鞘。

討論

在神經生理、生化和神經藥理的研究中、神經細胞的體外培養日益受到重視,因為它是研究單個神經細胞功能和結構的適宜方法。在體外培養條件下背根神經節、頸上交感節、胚胎脊髓和不同腦區 (海馬、隔、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細胞等)培養細胞的形態特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關。交感和感覺神經元以及不同腦區神經元的體外培養成功, 為我們深入研究它們的結構和功能提供了合適的體外實驗模型。

在背根節神經細胞培養過程中, 我們觀察到, 早期感覺神經元發育階段,NGF是必不可少的營養因子,但在培養后期,神經元已發育成熟, 可能非神經細胞分泌的極少量NGF即能滿足神經元生長需要,因此不另NGF也能維持長期培養。在上頸交感節細胞分散培養過程中, 我們亦觀察到,若最初1-2d在培養液中缺乏 NGF,交感神經元突起不見生長,且大多死亡。培養15d或1個月時,如果培養液中未加入NGF, 本來生長良好的神經元很快便出現顆粒變性或空泡, 逐漸死亡。

結果表明NGF對于促進神經突起生長和維持神經元生存有顯著作用。在神經細胞培養過程中,神經細胞的生長發育受到多種因素的影響,其中細胞接種密度對細胞生長發育影響較大,一般神經細胞的接種密度以0.5-1×106 個細胞/ml密度為宜,如每毫升中超過3×106個細胞/ml密度 ,將使細胞簇過大,而且培養皿內過分擁擠, 影響存活和生長。

但如果培養的細胞數目過少時,神經細胞的生長分化較差,因為神經細胞是一種細胞群體, 它們相互之間具有營養和支持作用。其次是控制非神經元細胞過多增殖。原代分散單層培養是神經細胞與非神經細胞的混合培養。其中膠質細胞等可在體外繼續增殖, 神經元則不能增殖而只能生長分化。當適量膠質細胞的存在是神經細胞長期培養的必要條件,但如果神經膠質細胞過渡增殖時，神經細胞的生長分化便受到一定影響, 常使神經細胞提早開始退化。

這可能是由神經膠質細胞頻繁分裂過程中, 奪取了神經細胞生長中需要的某種營養成份。為保證神經元生長所需的營養, 需在非神經細胞增殖的高峰即所謂“合流”(confluence)時,將一定量的抗DNA 藥物加入培養液中以抑制其過渡增殖,實驗證明,在培養第5d 或第7d時使用 5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml,作用48h即停用可加快神經元的分化, 延長培養時間。

再次是所配制的培養液必須保持一定的等滲性, 溶解于培養基的物質濃度所產生的等滲性必須與細胞外液的液體一致,培養神經細胞可將培養液的滲透壓調節到320-330 mOso 較為合適。如果培養液是高滲的,細胞會失去水份并發生皺縮, 如果培養液是低滲的, 細胞會吸收水分而膨脹。

兩者不利于神經細胞的存活和生長。 最后需注意的是須掌握換液的次數和數量。為了使神經細胞得到生長分化必須的營養,必須經常進行換液,但如果換液次數太多,并不利于神經細胞的生長分化,因為神經細胞在培養液中需要適當的環境,而且它本身也有創造良好環境的能力, 如果頻繁換液就會破環這種環境。我們每周換液二次,每次只換一半, 保留一半原液。除此之外,培養液的PH、溫度等均對神經元的生長發育有影響,因而在實驗中必須加以注意。

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