CD34陽性細胞計數

外周血現已被廣泛地被用作骨髓移植、癌癥患者接受大劑量化療或放療后骨髓重建造所需血干細胞（ Hemotopoietic Progenitor Cells HPC ）的來源。外周血源性干細胞現主要被運用自體移植，其應用面也逐步拓展至異基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作為造血干細胞的來源有著以下優點：

1 ，易采集；

2 ，對供者無需全身麻醉；

3 ，減少了采集后并發癥的發生；

4 ，受者造血系統重建快；

5 ，費用低；

6 ，住院時間縮短或可部分或全部在門診處完成操作。

相對于骨髓，外周血中的造血干細胞一般只出現一次高峰，其數量取決于供者血體積和 / 或單個核細胞的數量。由于外周血中造血干細胞含量很低，固常規中運用多極分離技術來收集這些細胞。在早期臨床研究中，收集的干細胞作為移植物數量是否足夠很不清楚。因為要檢測這些細胞數量需要使用集落形成實驗，但此法明顯不適用于臨床，因其大致需要 12-15 天時間出結果，故無法滿足臨床中當天出報告決定移植是否繼續的要求。此問題自發現 CD34 抗體可鑒別造血干細胞，并成功地被運用流式細胞儀定量檢測造血干細胞后被圓滿解決了。

CD34+ 造血干細胞植活最低數量要求是 2-5 x 106/ 公斤體重。然而正常人外周血中干細胞數量只占所有有核細胞的 0.1% 。很明顯這些數量的干細胞是不足夠運用于移植的，除非使用恰當技術增加外周血干細胞的含量供采集。此技術可通過給予供者集落刺激因子（通常是粒或粒 - 單集落刺激因子），同時可聯合骨髓抑制劑（如環磷酰胺）的方法動員造血干細胞進入循環外周血中。聯合使用化療藥物與集落刺激因子造成短暫的循環血中髓系細胞抑制，隨后使骨髓代償性地釋放髓祖細胞、造血干細胞至外周血，從而達到動員干細胞的目的。

聯合使用細胞毒藥物與集落刺激因子可延長抑制時間，相對于單獨使用集落刺激因子可增加動員至外周血中的干細胞。對于正常人供者不可使用化療藥物來抑制外周血，常使用 G 或 GM-CSF 、血小板刺激因子來動員。關于如何使用動員藥物請參見其他相關文獻。

早期外周干細胞計數

在尚未應用流式細胞儀定量檢測 CD34+ 細胞時，外周血干細胞計數常運用單位 - 粒 / 巨噬細胞集落形成實驗間接求得。這項檢測技術通過直接計數干細胞形所的集落來反映干細胞的數量，故被認為是檢測是否存干細胞的金標準。但也有學者置疑此檢測是否與移植成活率有很好的相關性。因為在這項技術中，各研究單位缺乏統一的檢測標準；刺激因子不同的處理方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的計數方法都造成了統計數據具有很大的變異性。常規體外集落形成實驗主要檢測髓系祖細胞并要求大約 14 天取得結果，使得該項檢測無法來確定臨床何時采集干細胞；所以以前只根據循環血中的最大集落數（ CFU 而非 CFU-GM ）來確定采集多少細胞.

使用 CD34 識別造血干細胞

自從發現、純化、標記抗 CD34 單克隆抗體開始，使流式細胞定量檢測在外周血或骨髓中的 CD34 陽性造血干細胞成為了可能。 CD34 抗原存在于各種祖細胞上，其中包括多能干細胞和間質干細胞。在某些組織的上皮細胞上也有表達。 CD34 抗原的分子量為 105-120KD ，具有一個高度糖基化的類粘蛋白的結構。內皮細胞的 CD34 抗原與 L 選擇素結合，然而造血干細胞上的 CD34 抗原的配體至今還未發現，有學者認為此抗原在細胞粘附中起作用。通過與不同特異性的 Vibrio cholera 神經氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶作用可區分出此抗原的不同位點。

這些位點根據其與不同的抗體結合情況可分為 I ， II 和 III 類，最近有報道 I 和 II 類抗原應屬同一家族，因為它們具有相似的抗原結構和功能屬性。這些研究都是基于交叉封閉實驗的，故不可作為評價抗體結合效率或抗原空間結構之用。 II 類抗原位點具有由非糖基化氨基酸構成的線性申展結構，四周由在遠 N 未端組成 CD34 的 I 抗原的類糖酶結構環繞。盡管 I 類與 II 類抗原幾乎合二為一，但它們化學和物理性質是不同的．

Siena 領導的工作組是第一個報道使用流式細胞儀定量檢測 CD34+ 造血干細胞的含量，來決定動員干細胞及采集最佳時間，并研究 CD33 在干細胞上的表達與移植效果的相關性。 CD34 陽性細胞運用 SSC 與 CD34 雙參數流式點圖來檢測。在此項研究中發現所有的 CD34 陽性細胞均與形成 CFU-CM 集落相關；并證實 CD34+ 細胞計數是決定干細胞采集時間有效方法。此外， Fritsch 及其工作組發現 CD34 陽性細胞比例與外周血單個核細胞數量和 CFU-GM 和 CFUGEMM 檢測的集落形成能力有相關性。這些結果被其他學者相繼證實，并使流細胞儀成為定量檢測 CD34+ 細胞成為監測動員干細胞和計數移植中造血干細胞數量的有效、精確的工具。

盡管以前工作已證實造血干細胞表達 CD34 抗原，但鑒別多能干細胞的復雜工作才剛剛開始。 Siena 及其工作組發現 CD34+CD33+ 雙陽性細胞數量與早期移植成功有相關性。同時 Tertappen 注意到骨髓中提取的 CD34+CD38- 陰性的細胞在 IL-3 ， IL-6 和 GM-CSF 刺激下能夠形成最原始的集落；隨著 CD38 抗原的增加， CD34 陽性細胞形成這種原始集落的能力下降。在 CD34+ 細胞中， CD34+CD38- 表型的細胞占 1.0% 左右。隨后又發現了其他細胞表面抗原在識別多能干細胞中起著重要作用。對于絕大多數臨床應用來說，計數 CD34 陽性細胞已足夠為移植提供可靠、持久的參數。然而計數更為原始的多能干細胞能夠提供其他重要的信息，所以有必要發展下面將敘述的技術來達成此目標。此外可發現、鑒別更新的一些干細胞抗體來提供更為直接的檢測方案，如： ACC-133 和 F84.1 。

在達到一個穩定、長期的移植成功的療效中， CD34+ 陽性細胞最少需求量方面還存在爭議。 Bender 發現大約 2x106 CD34+ 細胞 / 公斤體重的劑量能夠保證可靠的移植成功率。在許多病例中，這個劑量很容易從動員的病人或正常人中收集到。 Bensinger 及其工作組發現 CD34+ 陽性細胞與血小板、粒細胞重建時間有很強的相關性，并建議 CD34+ 細胞最佳劑量是 5x106/kg 。一個對 692 例自體移植病例研究也得出了相似的結論。

在移植前處理治療中，病人的耐受性及用藥的強度等因素會造成以上情況， Tricot 等觀察 225 例接受 PBPC 移植的病例和經 PBPC 輸入治療了難治性骨髓瘤患者，發現以上因素使自體移植中 CD34+ 細胞的最佳劑量各不相同。此研究表明，對于移植前接受化療少于 24 個月的病人，快速植活劑量應 >2.0 X 106 CD34+ 細胞 /kg ；對于長期接受全身化療的病人（大于 24 人月）最低劑量則為 >5.0 X 106 CD34+ 細胞 /kg 。

此處接受短期化療的病人更容易、快速地取得 CD34+ 細胞。總而言之，這些研究表達 2-5 X 106 CD34+ 細胞 /kg 的劑量對于大多數情況下是足夠的，但也有研究表明更高劑量的 CD34+ 細胞移植能夠幫助病例更容易克服組織相容性問題。以下將要討論有關 CD34+ 細胞的檢測技術，有些推薦劑量之間的差異正是由于檢測方案不同所引起的。

CD34 檢測方案變異系數及其標準化

流式細胞 CD34 干細胞計數為成為應用廣泛的實時檢測 PBPC 是否足夠移植的有效方法。對動員后供者循環外周血中 CD34+ 細胞絕對計數能夠預測采集物中干細胞的數量，并越來越多地用來決定何時可開始采集干細胞。根據 CD34 陽性細胞在樣本中的含量將決定是否繼續給予生長因子刺激、采集是否繼續。每次干細胞采集需要志愿者在護士的照顧下進行 3-4 個小時的干細胞分離過程，采集的細胞在體外需要進行特殊的處理或進行低溫保存。

從治療時間及消耗資源的意義上來說，以上動員、采集過程的費用是非常昂貴的，對于有經濟困難的患者來說此部分的費用占了移植總費用的重要比例。在早期的研究中，干細胞動員方案還未被應用，運用全部有核細胞計數作為移植物采集指標；有時會為單個病人采集相當于現在 20 倍數量的細胞用于移植，這不僅會增加標本保存成本，還會帶來病人體液過量的臨床問題。 CD34+ 細胞計數作為移植物采集量化標準解決以上所及的許多問題，但它也帶來許多新的疑問。

米蘭方案

第一個廣泛應用的干細胞計數方案是由 Istituto Nazionale Tumori in Milan 的 Siena 等人創立的米蘭方案（ Milan Protocol ）。在此方案中，需準備三管 50 ul 的血樣或 leukapheresis 樣本（如白細胞計數小于 150ul ，如受者樣本，則樣本和抗體均需加倍）；其中一管留出不作染色，一管加入 15ul 的抗 CD34 和 CD33 抗體，第三管則加入 15ul 的抗 CD2/CD19 抗體（計數 T 、 B 細胞）。

細胞在4 ℃下避光孵育 25 分鐘，之后加入紅細胞裂解液。孵育 15 分鐘后加入不含鈣、鎂離子的 PBS 洗液300g離心 7 分鐘洗滌，如果紅細胞裂解不徹底則可重復裂解過程。棄上清后細胞可在4 ℃保存并于一小時內上機檢測。在光散射參數中分析所有細胞，建立門圈定所有白細胞（排除碎片），并設立一門去除有自發熒光的細胞。在調節完補償后，分析 10000 個細胞， CD34+ 細胞可通過低 SSC 信號和 CD34 陽性表達加以區分。 CD34 弱陽性細胞一般不分析。

目前有很多米蘭方案的改進版，分別從：運用不同的 CD34 抗體、不同的溶血技術、加入其他抗體來提高鑒別力、變換熒光標記、使用 CD45 抗體或其他核酸染料來更方便地鑒別白細胞等方面進行改進。運用這些技術后，報道的移植所需足夠的并且能快速完成的 CD34+ 細胞數量有著巨大差異。經過仔細研究發現這些差異是由于在 CD34 細胞計數過程中運用了不同的標本處理、染色和分析方法造成的。因為在未動員的正常外周血中， CD34 陽性細胞通常小于全部有核細胞的 1% ，在經 G-CSF 動員后志愿者外周血中會大于 5% （有時在用血小板形成因子動員時可大于 20% ），對它們的精確計數對許多流式實驗室是個重要的挑戰。特別在計數小于 1% 時，又要做出檢測來決何時進行采集時，精確計數顯得格外重要。

Multi-Center 方法研究報告

Multi-Center 研究所在北美、歐洲、澳大利亞所做的一系列研究使得在精確計數中存在的儲多問題逐步浮出水面。其中的一些問題最先在法國馬賽招開的歐洲外周血干細胞計數研討會中提出。在此次會議中，討論了臨床的 CD34 計數的價值與在各種檢測方案中所應用的不同技術。并就外周血干細胞計數標準方案達成了一致。推薦方案中要求標本需預先作白細胞計數，用來染色的標本體積根據對 CD34+ 細胞數量估算來決定，分析時要求收集足夠的有統計學意義的標本數量。

方案中推薦使用雙標記方法染色，其中包括將 2 ul 的 PE 標記的 CD3 抗體和 10ul 的 FITC 標記的 CD34 抗體（ QBEnd10 ）加入 250ul 的全血進行染色，室溫下孵育 20 分鐘，每 5 分鐘用移液器吹打混勻一次；隨后加入 Ortho 公司的紅細胞裂解液孵育 9 分鐘，每 3 分鐘震動混勻一次；之后細胞在300g離心三分鐘洗滌一次并用 PBS 重懸。使用改進的米蘭方案進行檢測，在光散射圖中設門去除死細胞和碎片后分析 50000 個細胞。如果 CD34 陽性細胞計數小于 0.1% ，則需進一步分析，運用 FL2 設門去除 CD3+ 細胞群體和散射圖中設門去除單核和粒細胞后再次分析。

馬賽干細胞會議發展并拓展了一系列干細胞生物技術、干細胞計數和臨床應用方面的歐洲協作組。其中最為重要的是， Sovalat 等人向 22 個實驗室發送了新鮮的白細胞采集樣本和相應檢測單抗供染色與分析。由于使用了不同的檢測技術得出了變異很大的計數結果，其變異率達 15-100% 。對染色方案中最具統一性的步驟是運用同型對照來去除非特異性染色。

使用 FITC 標記的 CD34 抗體，克隆號為8G12 的其結果范圍為 0.00-1.29% ， QBEND10 抗 CD34 的抗體為 0.17-17.8% 。其中一個中心運用8G12 測不出任何陽性顆粒，五個實驗室報告 QBEND10 抗體測不出任何結果。運用 PE 標記的 CD34 抗體，結果的變異性要小得多，然而根據資料發現8G12 抗體檢測的結果比 QBEND10 的結果變異率要高。只有一個實驗室報告使用 QBEND10 無法得出檢測結果。

英國流式細胞儀臨床應用協會開展了更為廣泛的研究，在此項研究中共分別向 15 個單位分兩次派送了總共 28 份的白細胞采集品，其中 CD34+ 細胞的含量為 0.08-19.31% ，由此可得出檢測結果在實驗室內和外的變異率。每個樣本實驗室都按自己的計數方案進行檢測，隨后數據統一匯總。 CD34 陽性細胞的含量檢測結果的最大 CV 為 100.1% ，絕對計數的 CV 為 136.6% 。

隨后 Multi-Center 分析方法的應用系統地衡量了在 CD34 計數檢測中的變化因素，其中包括：樣本的運輸、準備、染色、收集和分析。雖然其中涉及了很多因素很難分析，但依然發現許多關鍵問題所在。一項在北美 10 個研究單位中開展的實驗中， Brecher 將 21 份已洗滌的骨髓或 PBPC 樣本重復送至各研究所，并用其自己的方案染色和分析。其中三家單位應用統一的檢測方案。 CD34 含量檢測結果的變異數使用每個送檢樣本所得結果的最大值與最小值來表示：范圍為 2.9 至 749 ，中位值為 76 。如去除其中兩個實驗單位報告的最高結果，變異范圍縮小至 1.2 至 27 之間（中位值為 3.1 ）。

在那些將方案標準化的實驗室中，其變異范圍為： 1.2 至 4.4 之間。在重復性方面，最小變異范圍為 0 至 16.5 ，最大到 4.1 至 133 （這個單位只分析了 10000 個細胞）。在 CD34 絕計數中的變異范圍則是“令人驚恐的”。如此巨大的變異是主要由于設門方案的不同引起的，并能通過使用標準化方案減小差異。澳大利亞的一個 Multi-Center 研究組證實這個結論，他們將 PBPC 標本派送至 20 家參與單位用其自己的方案進行檢測。

CD34+ 細胞的比例范圍為 0.64-2.80% ，中位數為 1.54% 。 20 家參與單位中，其中 9 家的結果在中位數的 10% 范圍以內。將 List mode 文件給予 24 家參與單位并用其自己的方案分析，發現其差異主要由所用的分析方案不同造成的，有 17% 的單位檢測結果超出中位數 10% 范圍；當所有參與單位統一使用相同的分析方案則只有 0-7% 的單位超出 10% 的限制。最具統一性的方案是 ISHAGE 多參數分析方案，所有參與單位分析結果全部落于中位數的 10% 以內。

在一項由 Lumley 組織的研究中，他將冷凍保存的白細胞采集品在冷藏條件派送至 8-12 家參與單位分析其中 CD34 陽性細胞的百分比含量。研究的第一步是將 12 份標本送至 8 家參與單位，每家單位使用其自己的染色、分析方案（基于米蘭方案）進行檢測并獲得結果。對所有結果匯總統計發現其 CV 值為 50-235% ，在統計學上有顯著差異，其中一家單位的結果顯著地與其他單位檢測結果差異的 5% 水平。第二步研究是將另外 12 份樣本送往 12 家參與單位，每家單位使用克隆號為 HPCA-2 ， PE 標記的 CD34 抗體，并用 FITC 標記的 CD45 識別白細胞，收集 50000 個細胞，但實際中有 27% 的單位沒有收集如此多的樣本進行分析。對全部結果匯總分析后，其 CV 值為 23-127% ，雖仍具有統計學差異，但沒有哪家單位的結果與其他單位結果的差異在 5% 水平。

此時，去除那些  平均值的結果，發現這些值都出于同一實驗室。經匯總統計發現，使用標準方案得出的結果降低了結果的 CV 值：由第一階段的平均 CV 值 137% 降至第二階段的平均 CV 值 69% 。但這也可能是因為第二次計數獲得的檢測結果比第一次高（第二階段 1.92% VS 第一階段 1.23% ）造成的。此研究表明各個實驗室之間 CD34 計數結果的 CV 值仍過高以致于無法比較各個實驗室所檢測值。

其他研究組也對影響計數結果的因素進行了廣泛的檢查，如通過提供統一試劑或發行標準分析方案來進行。盡管這些研究減少了一些檢測差異，但要進一步地提高實驗的精確性需對各個檢測中心進行全面的培訓并發展標準的計數方案。

此項工作由 Nordic Myeloma 研究組廣泛開展，他們組織了兩個協作組來制定計數標準方案并在 24 個實驗室中進行來提高 CD34 計數的準確性。第一次協作工作主要集中于標準化標本處理方法；其間制定了一樣本處理的標準方法：要求樣本在 4 小內分析；使用 Ortho 溶血劑與標本孵育 8 至 10 分鐘溶血； 5-10 x 105 細胞與克隆號為 HPCA 的 PE 標記的 CD34 抗體室溫下孵育 15 分鐘，同型對照同等條件處理；洗滌 2-3 次后用 150ul 1% 的多聚甲醛固定。用米蘭方案識別低 SSC 信號的 CD34 陽性細胞，共分析 50000 個完整細胞，并減去同型對照陽性顆粒的數量。

在第二次協作中， Nordic 首先向參與單位分發了含有三個病例 List mode 數據的磁盤供分析。發現在參與單位之間的分析結果差異很小（如對于含有 0.29% 和 1.36% 的兩個樣的標準差分別為 0.04 和 0.17 ）。隨后參與單位又收到了先染色后固定的和還未染色的兩種樣本。隨后對 24 家參與單位的 22 家結果分析表明結果比較一致（ r>0.9 ），盡管其中有實驗室一直報告較高或較低值。

在三階段中，參與單位要求使用第一次協作中制定的標準方案來檢測送檢樣本。結果顯示 CD34 計數的平均值為 0.68% ，標準差為 0.08 。使用更為統一的方案來檢測下一標本時，其平均值為 3.0%+0.26 ，范圍是 2.6-3.3% 。最終的推薦方案是：溶血步驟可在染色前或染后進行；加與不加鼠 IgG 來封閉非特異染色不影響結果；如果檢測中發現有非特異性染色，則需阻斷后再進行檢測；無需對樣本進行過濾；孵育與分析之間樣本最好只洗滌一次。為了絕對計數 CD34 細胞，需對樣本進行 10 倍稀釋后進行白血胞計數。

應用標準化方案來計數 CD34 細胞在 Benelux 的研究中進一步被證實。實驗室之間在未用標準方案前的檢測變異系數 34-106% 在應用標準方案后下降至 18-30% 。錯誤應用方案后，變異系數又增加至 50-82% 。

這些研究表明，在 CD34 計數檢測中有眾多因素影響著計數的準確性。這些因素可通過以下操作步驟來去除這些影響： 1 ，盡量減少對樣本處理步驟； 2 ，使用適當標記的抗體； 3 ，選擇適當的陰性和陽性標本； 4 ，收集足夠的細胞數來降低變異系數； 5 ，采用標準設門和分析方案。但以上任何一條現都沒國際上通用的標準，很清楚我們需要為 CD34 干細胞計數設立一廣泛同意的標準來減少其中的變異性。現將一些標準總結如下。

樣本準備

現有很多種方法運用于干細胞計數的樣本準備及分析中。在早期研究中，細胞經常經 Ficoll 淋巴細胞提取液來富集單個核細胞，然后反推外周血或采集品的細胞比例。這種計算方法經常會得出不精確的評估數據，但能部分地反映標本中的細胞量。 Fritsch 報道單個核細胞分離操作會導致外周血中 26% 的、骨髓中 21% 的、采集品中 5% 的 CD34+ 細胞丟失。現在基本棄用單個核細胞富集法，而改用對全血進行溶血來去除紅細胞。在這個操作步驟中，在未經處理的標本中直接加入熒光標記的 CD34 抗體進行染色，通過加入溶血劑溶解紅細胞的步驟可在染色前或染色后進行。

這樣使經血球儀計數的白細胞數與流式細胞儀經 CD45 設門后計數的白細胞數更容易比較。一個對不同樣本處理技術的系統比較發現洗滌步驟會導致部分白細胞群體丟失，從而造成 CD34+ 細胞的過量計數。這種過量計數可通過在溶血后計數白細胞作為分母計算而非在溶血前來糾正。溶血后不洗方法可保存樣本中各種白細胞群體，但這樣會改變細胞的光散射信號并增加熒光的非特異染色本底。這樣就會導致底估 CD34+ 細胞絕對計數。

盡管每種標本處理方法都有其不足之處，但本研究推存使用：先裂解紅細胞；洗滌樣本；進行白細胞計數作為計算分母；最后進行染色步驟。在本研究中，筆者使用不含固定劑的氯化銨溶血劑（ Ortho 公司）室溫下溶血 5-10 分鐘，隨后洗滌 2 次后染色。對于先染色后溶血的樣本，要求白細胞數在 2000-3000/ul ，這樣可避免因樣本量過大而造成染色和分析時間加長；樣本在此法處理后無法再進行白細胞計數。相比而言，溶血 / 洗滌法可預先獲知樣本的白細胞數并能夠分析原樣中白細胞含量小于 50 /ul 的樣本。

溶血劑

通過對不同溶血劑（ FACS Lysing solution Bection Dickinson; Immunolyse Beckman-Coulter; Optilyse B Immunotech, ImmunoPrep Beckman-Coulter ； OrthoMune Ortho; ACK BioWhittaket ）的比較發現它們的效果各不相同。各染血劑溶血后 CD45 陰性碎片占總顆粒數百分比為： ACK ， Immunolyse: 80% ；其他溶血劑大約為 50% 。 Optilyse 和 FACS 溶血后淋巴細胞比例最低，當使用 ACK 和 OrthoMune 后 CD4 和 CD8 陽性細胞比例不穩定，但所有的這些溶血劑都能使 CD34 陽性細胞明顯地與陰性群體相區分。對于溶血及固定型試劑的檢測也得出了相似的結論。這些觀察結果顯示溶血劑并不象我們所認為的對 CD34+ 細胞計數無影響。要避免延長溶血時間，除非標本已置于冰上停止了溶血。

樣本問題

有些樣本可能存在某些特殊問題。血小板可能會與 CD34+ 或 CD34- 細胞結合影響精確計數。這個問題可通過增加 EDTA 來解決。聚集的血小板可能會與 CD34 、 CD45 抗體微弱結合，但可通過巧妙的設門方案將其去除。

樣本的儲存及運送

越來越多的采集品因要合并或體外富集或要被運送至流式檢測中心，樣本都需被過夜保存。在以上這種情況下，樣本中細胞群的活性和被分析細胞潛在的改變等問題逐步顯現出來。現在對這些細胞最佳的存儲及運輸條件現在還未明確地建立。各個實驗室對標本保存溫度從室溫至4 ℃不等；加或不加營養劑都有。不同的標本盛放容器和一些與血小板集聚有關的因素現已被嚴格限定。

Gutensohn 報道采集品在室溫下保存 24 小時后，用 HPCA-2 和 QBEND10 兩種克隆號的單抗檢測發現 CD34+ 細胞分別下降了 25.4% 和 27.0% 。樣本在運輸過程中的晃動會增加大概 10% 的抗體非特異性染色，主要是由髓系細胞和死細胞造成的。相對而言，如標本儲存在4 ℃條件下， CD34+ 細胞不會有明顯下降。盡管現在低溫運送標本已變得可行，但一些冷凍劑會影響細胞表面抗原的表達。 Rosillo 等人報道當髓細胞暴露在 DMSO 中時會使細胞下調表達 CD7 ， CD13 ， CD33 和 CD34 并且也影響一些其他一些抗原表達強度。但 Farley 卻得出了不同的結論，他發現冷凍劑即不影響細胞的光散射屬性也不影響細胞標本中 CD34+ 細胞的比例。現在由于樣本被廣泛運送檢測加之缺乏適當的標本儲存和運輸知識，又一些抗體會與死細胞起非特異結合，要求對樣本進行活性檢測來去除細胞中的死細胞。可用的試劑有 PI 、 7-AAD 或 LDS-751 。

CD34 抗體的選擇

對于 CD34 抗體及其熒光素的選擇現還有爭論。最初因缺乏直標的 CD34 抗體，采用未標記的 CD34 抗體與 FITC 標記的熒光二抗來間接檢測。這樣一來使原本復雜的檢測與二抗的非特異結合和如何識別陽性細胞等問題摻雜在一起，更難以處理。隨后一系列不同熒光素標記的 CD34 抗體的出現使以上情況有所改觀。這些抗體能與 CD34 抗原的 I 、 II 、 III 類位點結合， CD34 的不同抗原位點可根據其對不同的蛋白水解酶的敏感性來區分。對 Vibrio cholera 神經氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶敏感的稱之為 I 類位點，針對此位點的抗體克隆號有： MY10 ， B1.3C5 ， 12.8 和 ICH3 。對唾液酸不敏感但能與 PhG 粘附的稱之為 II 類位點，識別此位點的抗體是 QBEND10 。對以上幾種酶都耐受的，稱之為 III 類位點，可被8G12 、 TUK3 、 115.2 等克隆號的抗體可識別。

使用 III 類位點特異性抗體能最大限度地提高檢測的敏感度。這是因為抗體與熒光素結合后，其結構可能會發生改變從而導致一些抗體無法完全檢測某些樣本中的 CD34+ 細胞。基于以上情況，發現針對 I 類抗原的抗體此問題最為嚴重，它在與熒光素結合后，如 FITC ，即失去活性；此外還發現這些抗體與 PE 熒光素結合后其特異會嚴重下降。相對而言， PE 標記的 II 類抗原能夠檢測樣本的所有 CD34+ 細胞，但它一旦與 FITC 結合后也會喪失一部分結合能力。

使用抗 II ， III 類位點的抗體計數采集品與臍帶血中 CD34+ 細胞，發現其相關性系數為 0.975 。現普遍推廣使用與 III 類位點結合的抗體，這些抗體能有效地與多種熒光素結合如： FITC 、 PE 、 PerCP 、 APC 和 PE-CY5 。任何標記的抗體都要仔細觀察其是否會有潛在的交叉反應，此外還要注意它們可能會與某些樣本中聚集的血小板結合。

對于 II 類位點的抗體在計數骨髓或外周血中 CD34+ 細胞時，其有效性評價不一。有報道認為 QBEND10 抗體因其與死細胞的結合而增加非特異性染色且與目標細胞的結合強度也不高，所以它不適合作干細胞計數。但 FITC 標記的抗體確實存在以上情況， FITC 標記的抗體陰性檢測結果就能說明這種情況，而 PE 標記的抗體則正常。

陰性對照

干細胞計數中另一個難點是如何選擇一個恰當的陰性對照。一般在流式細胞儀上，選用與抗體標記相同的同型免疫球蛋白作為非特異性染色的本底，但這種方法沒有體現針對具體抗原的非特異性染色的情況。在用 CD34 抗體染色的標本中，目標細胞群可能少于總細胞群的 0.1% ；而只有目標細胞群大于 1% 時才合適用同型作為陰性對照，這樣就很難區分檢測管中的陽性細胞是特異性染色或非特異性的。

另一種可選方案是采用多參數設門技術來區分特異性結合群體。通常 CD34 陽性細胞同時也表達 CD45 ，并且這些細胞的光散射信號也有其特征。在 CD45/SSC 雙參數圖中， CD34 陽細胞與淋巴、單核、粒細胞相分離獨立成群。平行對比實驗發現用多參數設門檢測的陽性細胞中不含有熒光標記的同型對照陽性的細胞。實驗表明多參數檢測或結合邏輯設門將成為一標準，特別是在運用定量技術檢測特殊的染色細胞群體時。這個方案要檢測樣本中的極少數細胞群時顯得格外重要。

有學者建立了另一陰性對照方案，他將已與未標記的 CD34 抗體孵育后的標本再與熒光標記的 CD34 抗體孵育，此時陽性的細胞則算為非特異性染色。但考慮到未標記的 CD34 抗體也存在非特異性染色，可能會覆蓋標記抗體的非特異性染色。此法還未與同型對照作過比較。

陽性對照

在臨床檢測中需要檢測陽性樣本，據此來檢查操作過程是否正確，并可作為質控。在 CD34 檢測項目中，要取得易制備、穩定可靠的陽性標本并非易事。現有幾種制作方案被實驗室接受。陽性標本一般使用各種表達 CD34 抗原的細胞株來制備。運用最廣的是 KG1 這強陽性表達 CD34 的細胞株，當它被加入至臨床樣本中時，不會影響原樣本中的各細胞染色屬性（ Coulter 和 R&D 公司的質控試劑使用的就是這種技術）。

由于這些細胞形態較大有其特有的光散射屬性，它們作為 CD34+ 細胞加入未動員的全血中并不能很好的模擬真實的樣本，從而使檢測質控樣本的方案不能適用臨床樣本。雖然有可能從一個長期志愿者身上抽取樣本作為質控，但由于無法得知其真正的陽性細胞數，又該法很難常規單位實行所以并不理想。以上問題可通過收集同一個具有高和低 CD34+ 細胞數病人的標本，將其分裝后凍存。凍存后的樣本在光散射信號與 CD34 表達上與新鮮樣本比較一致。每天可檢測一管解凍扣的樣本作為陽性質控品。當使用這些樣本作質控時，要檢測樣本中細胞活性并要使用多參數方案來減小差異。

在美國，臨床實驗室中的操作技能考核也要同時進行，這些考核標準由若干家研究機構的臨床流式實驗室共同制定，其包括 College of American Pathologists 和 PTP 。這些測試是在正常樣本或白血病樣本上進行的，而不使用 CD34+ 的血細胞樣本。這是由于各個實驗室對 CD34+ 細胞計數報告的給果差異實在太大，又不能找到大批量、穩定的、已了解清楚的樣本來進行考核。如能夠制備出抗原染色穩定、適用面廣、儲存方便、使用效期長的質控品，則以上問題可得到解決。如以上任務能達成將能加速發展能減少實驗室間與實驗室中變異的實驗技術。今后或許可使用流式標準微球來達成此目的。

樣本獲取

另一個值得注意的問題是在干細胞計數中要分析多少個細胞。傳統實驗中，如分析目標在白細胞群體中，一般采集 5000 至 10000 個細胞分析。但當進行 CD34 干細胞計數時，由于 CD34+ 細胞一般只占 1% 整單個核細胞，固可將其視作泊松分布曲線，如要得到一個變異系數為 10% 左右值，就要采集 100 個陽性細胞；采集的細胞數量要根據 CD34 細胞的比例來決定。盡管理想狀態下，應對每個樣本采集盡可能的細胞進行分析，但鑒于標本細胞的數量、流式所有軟件的功能、和數據的存儲空間等因素的限制而無法做到。普通實驗室一般在未設門的光散射圖中收集 50000 至 75000 個細胞進行分析，來獲得一個比較精確的結果。在分析過程可通過設門排除死細胞，但一旦去除這些細胞會使其后所分析的細胞群體數量減少。

數據分析

如上分析所見，要檢測陽性細胞需要進行雙參數或多參數分析。后者多參數分析有助于排除樣本中 CD34 弱表達群體，其可能包含細胞碎片或其他非干細胞顆粒。許多實驗室還加檢了 CD38 、 CD33 和 CD90 來進行一步計數更為原始的干細胞，或來尋找與臨床移植效果更有相關性的細胞群體。這種分析要求流式操作者具有更多的操作和統計技巧。現有很多分析方案可用于此目的；其中一些是基于原來米蘭方案修改而來，它是通過 CD34/SSC 設門去除細胞碎片、紅細胞和聚集物；陽性顆粒需要滿足： CD34 陽性表達， SSC 信號較弱，細胞獨立成群。有學者使用 7-AAD 染色去除死細胞，用 CD14 去除單核細胞的方法來分析。首先設門選取 7-AAD 陰性的細胞，并將其顯示在 CD34/CD14 雙參數圖中并從中去除單核細胞；在此方案中，可將 CD34 陽性細胞再次顯視在 CD34/SSC 圖中分析并與相應的同型對照作比較。隨后對于以上方案又有修改，將 CD45 替代 7-AAD 設立白細胞門，后進行分析。

ISHAGE 方案

Sutherland 于 1994 年在它的研究使用與以方案相似的手段分析，隨后此方案被 ISHAGE 收錄作為推薦方案使用，旨在確立一個普遍通用的、可排除實驗室中或實驗室間差異的方案。這個方法是由門不斷累加來完成的。第一個門是基于 CD45/SSC 雙參數圖上的；通過對其設門可去除紅細胞、碎片、和聚集物，這些干擾在造血細胞樣本中尤為多見，特別是在樣本使用溶血 - 免洗法處理后。通過此步驟也為以后計算 CD34 陽性細胞比例提供了可靠的分母（總白細胞數量）。在 R1 門中，最少要包括 75000 個細胞，并在 R4 門要計數超過 100 個 CD34 陽性細胞。將通過 R1 門獲取的細胞顯示在 CD34/SSC 雙參數點圖，在此圖中設立 R2 門并調節其位置包含所有 CD34 強陽性或弱陽性的并 SSC 信號弱及中等的細胞。

建立一 CD45/SSC 雙參數點圖，將以上 CD34 陽性細胞顯示于其中；在其中設門 R3 門去除 CD34 陽性顆粒中的聚集血小板、淋巴細胞和單核細胞。將 R3 門中圈定的細胞顯示在 FS/SS 圖中以檢測細胞是否落在平時的幼稚淋巴細胞門 R4 中，通過 R4 要去除比淋巴細胞小的顆粒。（注：如何確定 R4 門的位置呢？方法如下：在 CD45/SSC 雙參數點圖中設立 R5 門圈定 CD45 強陽性且 SSC 低信號的淋巴細胞群體，將 R5 門中的細胞顯示在 R4 門所在的 FS/SS 雙參數直方圖中，根據其中的淋巴細胞的位置調節 R4 門，確定 R4 門在 FS 和 SS 軸上最小值的最低范圍。）在臍血標本中，會出現 CD45/CD34 雙陽性的血小板集聚顆粒，但它們的側向散射光弱于真正的 CD34 陽性細胞，可被處于幼稚淋巴細胞位置的 R4 門排除。最終在 R4 門中讀取 CD34 陽性干細胞計數的數值。此時如檢測 CD45/ISOTYPE 雙染的陰性對照，在 ISHAGE 方案設門分析，在 R4 門中幾乎不見非特異性染色的顆粒存在。如在某些情況下 R4 出現非特異性染色顆粒，則在樣本計數時要從 R4 門減去非特異性染色的細胞數。

對于此方案有一爭論，是否所有 CD34 特異性染色的顆粒 CD45 都是弱表達。這了解決此疑問，在儀器調節和設門方面又作了改進，兩個獨立的直方圖被加入上述的四圖型方案中。在第個直方圖中增設 R5 門來精確圈定淋巴細胞： CD45 強陽性且 SSC 低信號。并將這些細胞顯示在第 6 個 FS/SS 雙參數直方圖中。據此可確定 R4 門的圈定幼稚淋巴細胞最小范圍（第 4 個直方圖為第 6 張的拷貝）。

這樣就能最大限度地去除血小板、未裂解的紅細胞、和其他碎片。這張直方圖還可以確定 FS 的預值設置是否適當， FS 和 SS 的電壓設置是否足夠。因為在此圖中要確保 CD45 陽性的最小淋巴細胞能夠適當地在 FS/SS 圖中顯示出來。建議最小淋巴細胞的 FS 參數強度在 1024 線性坐標上，位于 200 左右的位置上。當 FS/SS 的電壓及域值都設置完畢后，調整第 1 直方圖中 R1 門的位置，使其包括所 CD45 弱陽性和陽性顆粒。 R1 門在 CD45 從標的下限則根據以下直方圖來確認：建立第 5 張 CD45/CD34 雙參數直方圖，根據 CD34 陽性顆粒的 CD45 表達的最小值建立十字門，確保所有 CD34 陽性 CD45 極弱表達的細胞全部在 CD45 設定界線的左側；然后根據此進的 CD45 界線位置確定 R1 門的最小值。

CD34+ 細胞百分比檢測可通過對白細胞決對計數轉換成 CD34+ 細胞決對計數。在原有的 ISHAGE 方案基礎上，在第三或第四熒光通道中檢測已知數量的標準微球便能達成以上目的。這樣就能使無法定量的單平臺流式細胞儀變為能直接絕對計數干細胞的精確儀器。 ISHAGE 方案完全兼容使用 7-AAD 熒光染料進行樣體活性檢測，這樣就能在樣本中絕對定量計數有活性的 CD34+ 陽性細胞。這一點對臨床上在檢測抽取或合并時間過長的樣本時十分有意義。

DNA/RNA 染料 /CD34PE/CD45PC5+ 定量熒光微球（ PerfectCountR kit for CD34+ Cell Enumeration , Multi Sciences Co.Ltd ）檢測試劑盒分析說明

DNA/RNA 染料在 FL1 中檢測，用來識別所有有核細胞，在流式細胞儀分析時作為圈定白細胞的基礎。

采用標準 ISHAGE 方法進行 CD34PE/CD45PC5 染色分析，絕對定量微球 BD 機器在 FL4 通道內檢測， Coulter 機器可在 FL3 通道內檢測。