Western Blot實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)膜和封閉的注意事項(xiàng)

• 生物實(shí)驗(yàn)中的封閉劑

經(jīng)典的轉(zhuǎn)膜方法是電轉(zhuǎn)移，因?yàn)殡娹D(zhuǎn)移需要配套垂直電泳槽 來進(jìn)行。如何做這個(gè)“海綿—幾層濾紙—膠—膜—幾層濾紙—海綿”的“三文治夾心”，在分子克隆上已經(jīng)有詳細(xì)的介紹，相信大家都很容易找到。一些細(xì)節(jié)：

記得全程手套操作，一則避免手印污染影響結(jié)果，二則保護(hù)自己(未交聯(lián)的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即致命但都會(huì)慢慢毒害你的身體，可不要這樣白白為科學(xué)獻(xiàn)身哈)

如果WB前沒有可參考的資料——比如不知道是否有表達(dá)，比如抗體少還要摸條件(稀釋度)，可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn)時(shí)間省點(diǎn)試劑;

去掉積層膠后，預(yù)染的Marker可用以識(shí)別膠上下方向和膜的正反面(預(yù)染Marker如果照著說明書用量，有可能在電泳時(shí)看不到條帶，但轉(zhuǎn)膜時(shí)有濃縮效應(yīng)而且背景白就可以看到了。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個(gè)用量，或者多加1—2倍的量);如果目標(biāo)蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示劑已經(jīng)跑出去了，就要留意分清膠上下方向，切個(gè)小角是常用的方法。膜上要做好標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下。剪一個(gè)小小角最方便。膜和濾紙一起裁最好(不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀+尺子+墊厚報(bào)紙劃比較容易)盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下后用電泳緩沖液平衡過再量。我自己通常剪的時(shí)候會(huì)故意長(zhǎng)寬各比膠少1mm，保證膜和膠不會(huì)碰到對(duì)方背后的濾紙就好。

對(duì)于特別小的蛋白，tricine SDS-PAGE電泳 有助于提高蛋白大小在1KD—20KD間的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的濃度也不用太高(可參考2004年中國生物工程雜志上有一篇文章(有效分離1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法)，87年Anal.Biochem也有一篇文獻(xiàn))。

轉(zhuǎn)膜前膠要在轉(zhuǎn)移緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進(jìn)一步去掉可能有礙轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測(cè)蛋白活性。

膜漂在水面(或者甲醇液面)讓液體從下通過膜上的孔滲上來以趕走膜內(nèi)空氣，膜徹底浸潤(rùn)后顏色會(huì)變深一點(diǎn)，任何白點(diǎn)或者斑都是沒有完全浸潤(rùn)的標(biāo)志，會(huì)影響轉(zhuǎn)膜的。最后浸沒入緩沖液里平衡。甲醇處理PVDF不要超過15秒。以后的步驟中不要讓膜干涸了，萬一不幸發(fā)生也用同樣處理。

電轉(zhuǎn)移緩沖液通常用Tris glycine系統(tǒng)，如果是轉(zhuǎn)膜后有部分樣品要蛋白測(cè)序 ，最好用CAPS緩沖液，減少甘氨酸對(duì)測(cè)序的污染。

半干電轉(zhuǎn)移(Semi-Dry)用經(jīng)過緩沖液飽和的濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)移槽，非常節(jié)約試劑，而且效果也好。由于不用“泡”在緩沖液中，半干轉(zhuǎn)不單可用均一緩沖體系，也可以做非均一轉(zhuǎn)移緩沖體系(配方下面有，還可以加 20 % (v/v) 甲醇，據(jù)說有助于增加轉(zhuǎn)膜效率和減少膠變形的，但據(jù)說也有可能影響抗體識(shí)別)。半干轉(zhuǎn)可以在30分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)膜(每平方厘米電流2.5—3.5mA，恒流，冷庫。如果電流要求小可以延長(zhǎng)到60—90分鐘，但要防止過熱。如果有那種溫度貼，可以貼上參考溫度)，即使205KD這么大的蛋白轉(zhuǎn)膜效率也高達(dá)80%。各種大小的蛋白的轉(zhuǎn)移效率都OK。半干轉(zhuǎn)可以上下層疊2塊膠+膜一起轉(zhuǎn)(面積還是按照單個(gè)計(jì)算)，或者并排放(2塊膠的面積計(jì)算)，只要控制好單位面積的電流強(qiáng)度和時(shí)間，防止過熱就好了。

Discontinuous blotting buffer to be used:

有人覺得轉(zhuǎn)膜加SDS有助于大分子 蛋白轉(zhuǎn)膜，我個(gè)人持保留意見，因?yàn)镾DS等去垢劑影響硝纖膜和蛋白的結(jié)合，反而不好。

如果只做western blot ，膜可以用麗春紅S染色并在脫色前照相，對(duì)后面的免疫反應(yīng)影響不大。不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色膜以免影響結(jié)果。如果有預(yù)染Marker需要用針或者筆扎眼記錄條帶位置，以免后面會(huì)洗掉而無法判斷結(jié)果。預(yù)染Marker也有助于判斷轉(zhuǎn)膜的效率和情況，如果比目標(biāo)分子大的Marker都已經(jīng)轉(zhuǎn)過去了，那就OK了。如果有能在Western結(jié)果顯色的Marker(比如生物通前面特別推薦的別出心裁 特別好用的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 誰可小看“蛋白標(biāo)準(zhǔn)”(下) )就更方便了。

有人說在中性條件下電泳有助于蛋白測(cè)序，如果要蛋白測(cè)序需要提前一天倒膠，并說預(yù)電泳6小時(shí)(有還原劑如Glycolate)后再倒積層膠。除了要做HPLC分析應(yīng)該用麗春紅S而不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色，其他的比如測(cè)序和或者PTH都可以選靈敏度高些的考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑。沒條件做，參考而已。

轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白條帶，有時(shí)這種快速的方法可以不用染色識(shí)別條帶，避免染色膜影響后繼實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)膜后的封閉注意：

轉(zhuǎn)膜后，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。脫脂奶是最常用的經(jīng)濟(jì)配方(實(shí)驗(yàn)太晚了還可以補(bǔ)充一下營養(yǎng)，哈哈)，用這種封閉劑由于里面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，可能造成背景污染而不適合生物素—親和素的檢測(cè)方法(如果用了生物素標(biāo)記的Marker而且結(jié)果背景較高，分析結(jié)果也有可能是受此影響)，脫脂奶也不適合堿性磷酸酶檢測(cè)(AP)方法。

如果采用堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，封閉劑最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸緩沖鹽加熱65度1小時(shí)確保堿性磷酸酶失活(可以加0.05%疊氮化鈉，新鮮最好)。經(jīng)濟(jì)的脫脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物選擇范圍也更寬，現(xiàn)在HRP是越來越普遍的選擇。但是疊氮鈉(NaN3)對(duì)辣根過氮化物酶(HRP)有滅活作用，如果用HRP檢測(cè)系統(tǒng)則封閉液不要加疊氮化鈉為好。切記。封閉時(shí)間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，后面就全白忙活了。

如果選用AP作為顯色方法，封閉時(shí)就要選擇Tris緩沖體系，不要用PBS，因?yàn)镻BS干擾AP。再想起什么再補(bǔ)充吧。下一篇轉(zhuǎn)到顯色試劑的選擇了.

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