細(xì)胞計數(shù)和臺盼藍(lán)染色

血球計數(shù)板每一大方格長為1mm ，寬為1mm ，高為0.1mm ，體積為0.1mm3 ，可容納的溶液是0.1?l ，那么每ml 溶液中所含細(xì)胞數(shù)即是視野中每一大方格中數(shù)出的細(xì)胞數(shù)的10000 倍。

實驗步驟

（一）準(zhǔn)備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板和蓋玻片，然后用吸水紙輕輕擦干。

（二）制備細(xì)胞懸液：用胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞或收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液。要求細(xì)胞密度不低于104 /ml ，若細(xì)胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液離心（1000rpm ，2min ），重懸浮于少量培養(yǎng)液中。

（三）加樣：將蓋玻片蓋在計數(shù)板兩槽中間。用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，吸取少量細(xì)胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片一側(cè)加細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。否則要將計數(shù)板和蓋玻片擦干凈重新加樣。

（四）計數(shù)：在顯微鏡下，用10 ×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時，只計左側(cè)和上方者，不計右側(cè)和下方者。

（五）計算：將計算結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度。

細(xì)胞數(shù)/ 毫升原液= （4 大格細(xì)胞數(shù)之和/4 ）×104 ×稀釋倍數(shù)

注意事項

（一）消化單層細(xì)胞時，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單個細(xì)胞懸液，否則會影響細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。

（二）取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液。在連續(xù)取樣計數(shù)時，特別應(yīng)該注意這一點(diǎn)，否則前后計數(shù)結(jié)果會有很大誤差。

（三）鏡下計數(shù)時，遇到2 個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算。如細(xì)胞團(tuán)占10% 以上，說明消化不充分；或細(xì)胞數(shù)少于200 個/10mm2 或多于500 個/10mm2 時，說明稀釋不當(dāng)，需重制備細(xì)胞懸液、計數(shù)。

培養(yǎng)細(xì)胞活力的檢測

臺盼藍(lán)排斥實驗

1.制備單個細(xì)胞懸液，適當(dāng)稀釋；

2.向細(xì)胞懸液中加入0.4% 臺盼藍(lán)溶液，使臺盼藍(lán)終濃度為0.04% ；

3 ．在三分鐘內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色。

注意事項：在三分鐘內(nèi)完成死細(xì)胞計數(shù)，否則部分活細(xì)胞也會被染色，影響實驗的準(zhǔn)確性。

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