凝膠色譜法知識(shí)介紹
凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。
一、基本理論
(一) 分子篩效益
一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。
小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。
分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會(huì)有好的分離效果。
因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。
大、中、小三類分子彼此間較易分開(kāi)，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短，分子較小的移動(dòng)距離較長(zhǎng)。
于是分子較大的先通過(guò)凝膠床而分子較小的后通過(guò)凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大，小分子通過(guò)時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過(guò)凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)”，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)
(二)色譜柱的重要參數(shù)
⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。
⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。
⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這部分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。
⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve 表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，（洗脫體積比較可以忽略不計(jì)），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。
當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開(kāi)始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。
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