用尼龍毛法分離B細(xì)胞
一、尼龍毛柱的制備
1.取直接3D，長度約10cm的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。
2.稱取50mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約5～6cm。此柱可分離約2×107細(xì)胞。將柱置－20℃可保存2～3個月。
二、分離細(xì)胞
1.取分離的單個核細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×107/0.5ml。
2.融化尼龍毛柱，以每分鐘5～7滴的速度放出Hanks液，并用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。小心將細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管。
3.在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置1小時。用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫細(xì)胞。洗脫液中含有純的T細(xì)胞。再用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈不粘附的細(xì)胞。
4.加入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置冰箱中冷卻。用4℃預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液分3～4次洗脫尼龍毛柱，每次0.5ml。可先夾住塑料管，用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利粘附細(xì)胞脫落，然后再洗脫。洗脫液中含有大量B細(xì)胞。離心1000×g 10分鐘，去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液同樣洗滌胞1次。計數(shù)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。
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