大鼠腦皮質微血管內皮細胞的培養
【摘 要】目的：培養腦皮質微血管內皮細胞。方法：取1～5d Wistar乳鼠腦皮質,經不同孔徑的篩網過濾后，用膠原酶振蕩消化獲得的微血管內皮細胞進行培養，用Ⅷ因子相關抗原免疫組化鑒定。結果：培養的細胞呈單層貼壁生長，7～9d呈典型的鋪路卵石樣征象。結論：建立了一種簡便易行的培養腦皮質微血管內皮細胞的方法。
【關鍵詞】 細胞培養；微血管內皮細胞；Wistar大鼠
腦微血管內皮細胞是構成血腦屏障的主要成分，具有特殊的形態結構和機能，在許多病理狀態下起重要作用[1]。建立腦微血管內皮細胞體外培養，可獲得大量比較單純的內皮細胞，為研究血腦屏障和腦血管疾病以及新藥篩選提供實驗模型。本文報告大鼠腦皮質微血管內皮細胞培養的一種方法。
1.材料與方法
1.1 鼠腦皮質微血管內皮細胞培養
1.1.1 鼠腦皮質微血管內皮細胞的分離 取10～12只1～5d的Wistar大鼠（重慶醫科大學實驗動物中心提供），雌雄兼用，于超凈工作臺上操作者左手拇食二指持乳鼠頸部稍下處，常規消毒頭皮后，右手持眼科剪沿正中線剪開頭皮與顱骨，用眼科彎鑷取出鼠腦。取出的腦立即放入盛有冰冷Hank's液的平皿中。去除大血管、軟腦膜、腦干、小腦和大腦髓質。將收集到的大腦皮質，轉入另一先放有170μm不銹鋼篩網的冰冷Hank's液的平皿中，用玻璃吸管反復吹打呈腦勻漿，棄濾液，再用Hank's液反復沖洗網上的血管，將收集的血管段液再經孔徑75μm尼龍網過濾，500轉離心3min，棄上清，收集沉淀的血管段。
1.1.2 原代微血管內皮細胞培養 將 微血管段移入0.1‰的Ⅶ膠原酶中37℃振蕩消化20min，800r/min離心3min，棄上清，沉淀物加入含15%胎牛血清的M199（完全培養液）制成細胞懸液，接種于35ml 塑料培養瓶(Nunclon)中（瓶底朝上），置37℃，5%CO2培養箱孵育，2h后翻轉培養瓶（瓶底朝下），1d后換全液，以剔除混雜的非內皮細胞，以后每3d換完全培養液1次進行細胞原代培養。
1.1.3 細胞傳代培養 細胞原代培養7～9d后，細胞呈單層密集生長近亞融合時進行傳代繁殖，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化細胞，見細胞大部分脫落時加入完全培養液終止消化,輕輕吹打,制成細胞懸液,按實驗需要傳代,傳代時接種密度為3×104 /ml。
1.2 特性鑒定
1.2.1 形態學 用Olympus倒置顯微鏡觀察內皮細胞的形態及生長規律。
1.2.2 用MTT法測內皮細胞的生長率 傳代培養至第3代，接種于24孔培養板中，接種密度為3×104/ml，在1～11d 內，每天收集3孔的細胞進行MTT法測細胞的活力。即細胞培養至所選時間，棄上清，每孔加入400μl M199，40μl MTT繼續培養4h后，離心2000轉，5min，棄上清，每孔加入400μl二甲基亞砜溶解紫色結晶，再轉入96孔板，于自動酶標儀上測定OD570 值，吸光度值的大小反映內皮細胞成活數量及活性。
1.2.3 免疫組化 將長有細胞的蓋玻片取出，用濃度為0.1 mmol/L PBS漂洗后，4℃丙酮固定10min，滴加Ⅷ因子相關抗原的抗體(博士德，即用型)，再按通用型SP kit (北京中山)說明進行操作，DAB顯色，封片后鏡下觀察和照相。
2.結 果
2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡觀察分離的微血管段形態各異，長短不等，呈單枝或多枝狀。經膠原酶消化后，微血管管壁不清，壁上內皮細胞清晰可見。2h后翻轉培養瓶，目的是去除首先貼壁的長梭形成纖維細胞。混懸液內還有未分離干凈的神經組織碎片和紅細胞，1d后換全液即可清除，換液后可見大部分微血管片段已貼壁，邊緣長出單個內皮細胞，呈三角形或長梭形，排列不規則，核淡，胞膜明顯，2～3d可見細胞分裂增殖形成散在細胞群落，7～9d融合成片狀，細胞緊密排列，互不重疊，呈典型的鋪路卵石樣結構(見圖1)。傳代細胞初種時為明亮的園球形，懸浮于培養液中，4h后大部分細胞貼壁，呈扁平狀，24h后細胞胞體變大，隨培養時間延長，細胞多呈三角形或長梭形，7d后細胞增殖成單層片狀。傳至第4代時細胞輪廓欠清。測定第三代內皮細胞的生長率表明內皮細胞的生長高峰在7～9d 以后不再增殖，出現生長接觸抑制現象。
2.2 免疫組化
原代、第三代內皮細胞進行ⅧF：Ag免疫組化檢查，95%以上細胞的胞漿和核膜周圍被染成棕褐色，證實培養的內皮細胞為血管內皮細胞。
3.討 論
血管內皮遍布全身，位于整個循環系統的內表面，它不僅是血管的被動襯里，而且是肌體最大的內分泌腺[2]。由于它所處的特殊位置，可通過不同的機制和生化信息，來釋放血管活性物質、細胞因子和生長因子，以調節免疫反應、血液流動性、凝血過程、血管床張力及通透性，參與正常和新生組織的血管形成。腦微血管內皮細胞是位于毛細血管微循環的一種特殊細胞，具有極其重要的功能。它是構成血腦屏障的主要成分，同時與腦水腫、腦血管疾病的發生發展、腦腫瘤的浸潤和擴散，尤其是腦腫瘤的血管形成等病理過程緊密相關。我們對鼠腦皮質微血管內皮細胞培養的償試，為體外研究各種顱腦疾病提供一種嶄新的實驗工具。由于不同來源的血管內皮細胞之間存在較大的差異性，人們常根據不同的研究目的選取不同的血管內皮細胞進行培養。
國外對腦微血管內皮細胞的分離培養始于70年代末，難點主要在于腦微血管分離步驟繁雜、內皮細胞難以純化，建立與維持微血管內皮細胞很難，且有些方法不適合于國內普通實驗室，如需要高速冷凍離心機和價格昂貴的內皮細胞生長因子等 [3]，故國內關于腦微血管內皮細胞培養方法的報道較少。我們根據本校條件，探討了培養大鼠腦微血管內皮細胞的方法，成功進行了Wistar 乳鼠大腦皮質微血管內皮細胞的體外培養。
根據我們的體會，培養時應注意以下幾點：
(1)仔細剝離軟腦膜，去除腦干、大血管、小腦和大腦髓質后，吹打成勻漿的腦組織經過 170μm和75μm兩種孔徑濾網過濾，這樣既可去除較大組織塊和大血管，又可達到收集微血管段的目的，因據Brendel等[4]研究發現鼠腦微血管的直徑在6～80μm之間，分離腦微血管多選直徑80μm左右的濾網篩選。
(2)膠原酶充分消化。我們用0.1‰的Ⅶ膠原酶在37℃恒溫搖床振蕩消化20min即可。酶充分消化有助于內皮細胞的遷移、去除周皮細胞。消化時間的長短因膠原酶的類型與不同的濃度而有所不同。
(3)原代培養時需收集到足夠量的微血管，否則培養難以成功。
(4) 原代培養2h后，翻轉培養瓶以去除先貼壁的成纖維細胞，24h后換液一次以去除未貼壁的雜質，凈化培養環境。開始培養的2～5d，在倒置顯微鏡下用機械方法(細胞刮刀)刮去可疑的細胞或細胞群落。
(5)傳代培養時，只收集最先脫落的細胞進行培養，這是因為內皮細胞具有貼壁早，而在酶消化時易脫落的特性[5]。
(6)培養內皮細胞最好選用含15%胎牛血清的M199培養液來培養，這樣有利于內皮細胞的生長、逐漸淘汰混雜的神經元和膠質細胞。
參 考 文 獻
[1] Chi OZ, Wei NM, Sinha AK, et al. Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia[J]. Pharmacology,1994;48:367-373.
[2] Inagami T, Naruse M, Richard H. Endothelium as an endocrine organ[J]. Annu Rev Physiol,1995;57:171-189.
[3] Gordon EL, Danielsson PE, Hguyen TS, et al. A comparision of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol,1991;27A:312-326.
[4] Brendel K, Meezan E, Carlson EC. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex[J]. Science, 1974;185:953-955.
[5] Browman PD, Betz AL, Diane AR,et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain[J]. In Vitro,1981;17(4):253-262.
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://www.njjinzhong.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
