細胞培養升級篇

細胞培養中的注意事項

1 冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？

除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用5 %或10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g時，細胞培養時應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應使用5% CO2培養細胞。

7 何時須更換培養基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

8 培養基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過高之轉速，將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

14 DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4 C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于4 C 30~60分鐘 → (-20 C 30分鐘) → -80 C 16~18小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 C 至-80 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 C 不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？

加入相應抗生素，直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2培養箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養基保存于4 C 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養基保存于4 C 冰箱中，培養基內之CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調整pH 值。

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？

研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80 C太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

28 如何選用特殊細胞系培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養最好首選AIM V（12005）培養基（SFM）。

29 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

30 GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

31 什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

32 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

33 目錄上說，Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

34 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

35 當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

36 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

37 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

38 在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。

細胞培養常見問題的原因及對策：

1. 培養液pH值變化太快：

CO2張力不對。培養瓶蓋擰得太緊。NaHCO3緩沖系統緩沖力不足。培養液中鹽濃度不正確。細菌、酵母或真菌污染。

按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。（2）改用不依賴CO2培養液。

松開瓶蓋1/4圈。

加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。

在CO2培養環境中改用基于Earle's鹽配制的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hank's鹽配制的培養液。

丟棄培養物或用抗生素除菌。

2. 培養液出現沉淀，但pH值不變：

用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養基成分沉淀下來。冰凍保存培養液。

用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌。

將培養液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養液。

3. 培養液出現沉淀，同時pH 發生變化：

細菌或真菌污染。

丟棄培養物或用抗生素除菌。

4. 培養細胞不貼壁：

胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養液中無貼壁因子。

縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。

5. 懸浮細胞成簇：

培養液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放DNA。

用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。

分離培養物，檢測支原體。如發現支原體污染，丟棄培養物。

用DNase I處理細胞。

6. 原代細胞培養物污染：

原代培養組織在進入培養前已污染

培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織。

7. 培養細胞死亡：

培養箱內無CO2。培養箱內溫度波動太大。細胞凍存或復蘇過程中損傷。培養液滲透壓不正確。培養液種有毒代謝產物堆積。

檢測培養箱內CO2

檢查培養箱內溫度

取新的保存細胞種

檢測培養液滲透壓。注意：大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260-350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。

換入新鮮培養液

8. 培養細胞生長減慢：

由于更換不同培養液或血清。培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養物中有少量細菌或真菌污染。試劑保存不當。

比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。

增加起始培養細胞濃度。

讓細胞逐漸適應新培養液。

換入新鮮配制培養液。

補加谷氨酰胺或生長因子。

用無抗生素培養液培養，如發現污染，丟棄培養物。或用抗生素除菌。

血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養液在2-8℃保存，并在2周內用完。

接種細胞起始濃度太低，細胞已老化，支原體污染。

增加接種細胞起始濃度。

換用新的保種細胞。

分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。

血清

1. 保存血清最好的方法?

建議血清應保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

2. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。

3. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理?

血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

5. 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?

GIBICO的胎牛血清沒有預老化，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

7. 如何避免沉淀物的產生?

解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產生沉淀物。解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

細胞分離試劑

1. 大部分連續細胞系，強貼壁細胞系，許多早代細胞

HBSS或無鈣鎂PBS

0.25％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中

2. 細胞表面蛋白完整性重要的連續細胞系

HBSS或無鈣鎂PBS

0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA

3. 弱貼壁表皮細胞轉化成纖維細胞（要求細胞表面完整性），原代細胞

HBSS或無鈣鎂PBS

EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中

4. 強貼壁早代細胞系

HBSS或無鈣鎂PBS

0.25％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS

5. 上皮細胞

0.5mM -1mM EDTA

0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS

6. 強貼壁細胞，上皮細胞，一些腫瘤細胞

0.5mM -1mM EDTA

0.25％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂PBS

7. 厚培養物，多層富含膠原的密集培養

1mM EDTA

0.25％胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中

北京天優福康生物科技有限公司

官網：http://www.njjinzhong.com/

服務熱線：400-860-6160 

聯系電話/微信：13718308763  

QQ:2136615612      3317607072

E-mail：Tianyoubzwz@163.com