免疫共沉淀技術(shù)路線

準(zhǔn)備工作：
預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)
1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS；
2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)
3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）
4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 離心管 中
5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 離心管 中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）
9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）
10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異
11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl“過(guò)渡抗體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）
13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）
15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。

RIPA Buffer配制：
基礎(chǔ)成分：
Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）
NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）
NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液）
去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液；避光保存）
注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。
RIPA蛋白酶抑制劑
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）
EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲(chǔ)存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）

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