蛋白復性（四）-淺談蛋白質折疊的有關問題
[摘要] 本文對蛋白質折疊這一古老的領域的最新發展，尤其是分子伴侶的機理作了一番探討，對一些新觀點和新的實驗事實作了介紹，并對一些實驗實事作了一些思考，并提出了一些自己的看法。同時預測了結構生物學及技術手段的發展趨勢。
[關鍵字] 生物大分子 分子伴侶 蛋白質的折疊 識別 結合
生物大分子的結構與功能的研究是了解分子水平的先象的基礎。沒有對生物大分子的結構與功能的認識，就沒有分子生物學。正如沒有DNA雙螺旋結構的發現，就沒有遺傳傳達傳遞的中心法則，也就沒有今天的分子生物學。結構分子以由第一分子進入對復和物乃至多亞基，多分子復和體結構研究。同時，過去難以研究的分子水平上的生命運動情況也隨著研究的深入和技術手段的發展而逐漸由難點變為熱點。蛋白質晶體學研究已從生物大分子靜態（時間統計）的結構分析開始進入動態（時間分辨）的結構分析及動力學分析。第十三屆國際生物物理大會的25個專題討論會中有一半以上涉及蛋白質的結構與功能，而“結構與功能”又強調“動力學（Dynamics）”，即動態的結構或結構的運動與蛋白質分子功能的關系，以及對大分子相互作用的貢獻。
蛋白質折疊問題被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題，它是分子生物學中心法則尚未解決的一個重大生物學問題。從一級序列預測蛋白質分子的三級結構并進一步預測其功能，是極富挑戰性的工作。研究蛋白質折疊，尤其是折疊早期過程，即新生肽段的折疊過程是全面的最終闡明中心法則的一個根本問題，在這一領域中，近年來的新發現對新生肽段能夠自發進行折疊的傳統概念做了根本的修正。這其中，X射線晶體衍射和各種波譜技術以及電子顯微鏡技術等發揮了極其重要的作用。第十三屆國際生物物理大會上，Nobel獎獲得者Ernst在報告中強調指出，NMR用于研究蛋白質的一個主要優點在于它能極為詳細的研究蛋白質分子的動力學，即動態的結構或結構的運動與蛋白質分子功能的關系。目前的NMR技術已經能夠在秒到皮秒的時間域上觀察蛋白質結構的運動過程，其中包括主鏈和側鏈的運動，以及在各種不同的溫度和壓力下蛋白質的折疊和去折疊過程。蛋白質大分子的結構分析也不僅僅只是解出某個具體的結構，而是更加關注結構的漲落和運動。例如，運輸小分子的酶和蛋白質通常存在著兩種構象，結合配體的和未結合配體的。一種構象內的結構漲落是構象轉變所必需的前奏，因此需要把光譜學，波譜學和X 射線結構分析結合起來研究結構漲落的平衡，構象改變和改變過程中形成的多種中間態，又如，為了了解蛋白質是如何折疊的，就必須知道折疊時幾個基本過程的時間尺度和機制，包括二級結構（螺旋和折疊）的形成，卷曲，長程相互作用以及未折疊肽段的全面崩潰。多種技術用于研究次過程，如快速核磁共振，快速光譜技術（熒光，遠紫外和近紫外圓二色）。
一、新生肽段折疊研究中的新觀點
長期以來關于蛋白質折疊，形成了自組裝（self-assembly）的主導學說，因此，在研究新生肽段的折疊時，就很自然的把在體外蛋白質折疊研究中得到的規律推廣到體內，用變性蛋白的復性作為新生肽段折疊的模型，并認為細胞中新合成的多肽鏈，不需要別的分子的幫助，不需要額外能量的補充，就應該能夠自發的折疊而形成它的功能狀態。
1988年，鄒承魯明確指出，新生肽段的折疊在合成早期業已開始，而不是合成完后才開始進行，隨著肽段的延伸同時折疊，又不斷進行構象的調整，先形成的結構會作用于后合成的肽段的折疊，而后合成的結構又會影響前面已形成的結構的調整。因此，在肽段延伸過程中形成的結構往往不一定是最終功能蛋白中的結構。這樣，三維結構的形成是一個同時進行著的，協調的動態過程。九十年代一類具有新的生物功能的蛋白，分子伴侶（Molecular chaperone）的發現，以及在更廣泛意義上說的幫助蛋白質折疊的輔助蛋白(Accessory protein) 的提出，說明細胞內新生肽段的折疊一般意義上說是需要幫助的，而不是自發進行的。
二、蛋白質分子的折疊和分子伴侶的作用
蛋白質分子的三維結構，除了共價的肽鍵和二硫鍵，還靠大量極其復雜的弱次級鍵共同作用。因此新生肽段在一邊合成一邊折疊過程中有可能暫時形成在最終成熟蛋白中不存在不該有的結構，他們常常是一些疏水表面，它們之間很可能發生本不應該有的錯誤的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自組裝學說，每一步折疊都是正確的，充分的，必要的。實際上折疊過程是一個正確途徑和錯誤途徑相互競爭的過程，為了提高蛋白質生物合成的效率的，應該有幫助正確途徑的競爭機制，分子伴侶就是這樣通過進化應運而生的。它們的功能是識別新生肽段折疊過程中暫時暴露的錯誤結構的，與之結合，生成復和物，從而防止這些表面之間過早的相互作用，阻止不正確的非功能的折疊途徑，抑制不可逆聚合物產生，這樣必然促進折疊向正確方向進行。（從哲學的觀點說，似乎很容易駁斥自組裝學說，它違背了矛盾的普遍性原理，試想，如果蛋白質的每一步折疊均是正確的，充分的，必要的，豈不是在無任何矛盾的前提下，完成了復雜的最穩定構象的形成，即完成了由量變到質變的偉大飛躍，從無活性的肽鏈變成有活性的功能蛋白，這顯然是違背哲學基本原理的。換一個角度想，生物進化的過程本來就充滿著不定向的變異，這些變異中有適應環境的，也有不適應環境的，“物競天擇”，自然的選擇淘汰了那些不適應的，保留了那些適應的。蛋白質分子的折疊不也與此類似嗎？我想，蛋白質的一級結構只是肽鏈折疊并形成功能蛋白的特定三維結構的內因，實際上，多肽鏈在形成活性蛋白的每一步，都有潛在的可能形成“不正確”的折疊，如果沒有象分子伴侶或其它幫助蛋白等外部因素的作用，多肽鏈也永遠不能折疊成為活性蛋百。）
三，分子伴侶的作用機制
分子伴侶的作用機制實際上就是它如何與靶蛋白識別，結合，又解離的機制。有的分子伴侶 具高度專一性，如一些分子內分子伴侶，還有細菌Pseudomonas cepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侶”。它是由基因limA編碼的，與酯酶的基因LipA只隔3個堿基，可能是進化過程中發生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侶識別特異性不高，它是怎樣識別需要它幫助的對象的呢？現在只能說分子伴侶識別非天然構象，而不去理會天然的構象。由于在天然分子中，疏水殘基多半位于分子的內部而形成疏水核，去折疊后就可能暴露出來，或者在新生肽段的折疊過程中，會暫時形成在天然構象中本應該存在于分子內部的疏水表面，因此認為分子伴侶最有可能是與疏水表面相結合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水側面。但是只有β-sheet結構的蛋白質才可為分子伴侶識別。
最近關于識別機制有較大的進展。Bip是內質網管腔內的分子伴侶，用一種affinity panning的方法檢查Bip與有隨機序列的十二肽結合的特異性，結果發現，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hy motif與Bip j結合最強，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即較大的疏水殘基。一般來說，2-4個疏水殘基就足夠進行結合。還有一種較普遍的說法是分子伴侶識別所謂熔球體結構（moltenglobule）。另一方面，分子伴侶本身與肽結合部位的結構分析最近也有些進展。譬如，PapD的晶體結構表明，多肽結合在它的 β-sheet區。GroEL中，約40kD的153-531結構域是核苷酸的結合區。
分子伴侶作用的第二步是與靶蛋白形成復合物。非常盛行的一種模型認為分子伴侶常常以多聚`體形式而形成中心空洞的結構，用電子顯微鏡已經觀察到由二圈層圓面包圈形組成的十四體GroEL分子和一個一層圓面包圈的七體GroES分子協同作用形成中空的非對稱籠狀結構（cage model），推測靶蛋白可以在與周圍環境隔離的中間空腔內不受干擾的進一步折疊。但是不久前一個日本實驗室發現GroEL的一個亞基，甚至其N端去除78個氨基酸殘基的50kD片段，已經不能再組裝成十四體結構，都有確定的分子伴侶功能。由此，我想:也許環狀分子伴侶并非每個部位都是有效的結合部位，也就是說，該二層圓面包圈組成的十四體GroEL分子只有一個或若干個部位能夠與疏水殘基或所謂的熔球體結構結合，而其余部位起識別作用，就像一個探測器一樣，整個十四體GroEL分子以圈層或籠狀結構”包裹”在多肽鏈的主鏈上，以旋進方式再多肽鏈的鏈體上運動，一旦環狀多聚體的某一識別部位發現疏水結構或所謂的熔球體結構等新生肽鏈折疊過程中暫時暴露的錯誤結構，經信號轉導，多聚體的結合部位便與之結合，生成復合物，抑制不正確的折疊。以上完全是我個人的猜想，是基于上述兩個試驗現象的矛盾而試圖作一番解釋。至于為什么假設以旋進方式在多肽鏈上運動，我并沒有相應的根據，只是覺得這應該是一個動態過程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我覺得也許可以用X射線衍射來探測一下分子伴侶GroEL和GroES組成的籠狀結構，看看它的a×b×c是否足以容納多肽鏈的某一段，或者它的內部和外部的疏水性質和其他一些物化性質如何，也許可以找到支持或駁斥上述假設的證據。
以上談的都是蛋白質的分子伴侶。不久前又出現了一個新名詞“DNA chaperones”，DNA分子伴侶，這種分子伴侶是與DNA相結合并幫助DNA折疊的。在這種復合物中，DNA分子包圍在蛋白質分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上結構已有所改變的。DNA與蛋白的這種相互作用對DNA的轉錄，復制以及重組都十分重要;或如在核小體中，對DNA的包裝是必須的。DNA在溶液中的結構有相當的剛性，必須克服一個能障才能轉變成它的蛋白復合物中的結構，分子伴侶的作用就是幫助DNA分子進行折疊和扭曲，從而把DNA穩定在一個適合于和蛋白結構的特定構型中。這種結合是協同的，可逆的在形成復合物之后便解離下來。因此，不論是DNA分子伴侶還是蛋白分子伴侶，都與DNA和蛋白的相互作用有關，與基因調控有關，看來，分子伴侶確實與最終闡明中心法則當前主要問題有密切關系。
四、分子伴侶和酶的區別
與分子伴侶不同，以確定為幫助蛋白質折疊的酶目前只有兩個，一個是蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI); 另一個是肽基脯氨酸順反異構酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase，PPI)。以PDI為例，眾所周知，蛋白質分子中的二硫鍵與新生肽段的折疊密切相關，對維系蛋白質分子的結構穩定性和功能發揮也有重要作用。PDI定位在內質網管腔內，含量豐富，催化蛋白質分子內巰基與二硫鍵之間的交換反應。同時，它是目前發現的最為突出的多功能蛋白，除了二硫鍵的異構酶的基本功能外，它還是脯氨酸-4-羥化酶的α亞基;又是微粒體內甘油三酯轉移蛋白復合物的小亞基，還是一種糖基化位點結合蛋白(gkycisylation site binding protein)等。其中，最引人注目的還是它有與多肽結合的能力，可以結合具有不同序列，長度和電荷分布的肽，特異性較低，主要是與肽的主鏈相作用，但對巰基尚有一些偏愛。按照分子伴侶的定義，一般認為PDI和分子伴侶是兩類不同的幫助蛋白，但是我國上海生物物理研究所最近提出不同的看法，認為蛋白質二硫鍵異構酶也具有分子伴侶的功能。
蛋白質分子中天然二硫鍵的形成要求這些在肽鏈上往往處于不相鄰位置的巰基，首先通過肽鏈一定程度的折疊，才能相互接近到可以正確形成二硫鍵的位置。肽鏈的自身折疊是一個慢過程，而蛋白質二硫鍵異構酶催化蛋白質天然二硫鍵的形成卻是一個快過程。另一方面，蛋白質二硫鍵異構酶具有低特異性的與各種不同肽鏈相結合的能力，在內質網中以極高的濃度存在，又是是一個鈣結合蛋白，是一個能被磷酸化的蛋白，這些都已經符合了分子伴侶的條件。因此他們推測蛋白質二硫鍵異構酶很可能首先通過它與伸展的，或部分折疊的肽段的結合，阻止錯誤的折疊途徑，促進正確的中間物生成，幫助肽鏈折疊是相應的巰基配對，從而是正確的二硫鍵得以形成;然后催化巰基的氧化或二硫鍵的異構而形成天然二硫鍵。他們認為蛋白質二硫鍵異構酶的酶活性與它的分子伴侶功能不是相互排斥，而是密切相關，協調統一的。分子伴侶與幫助新生肽鏈折疊的酶之間，大概不應該，也不能夠劃一條絕對的分界線。我想:酶的最主要特性就是催化生化反應，分子伴侶的主要作用是與新生肽段的錯誤構象結合，從而阻止肽鏈不正確的非功能的折疊途徑，促使其向正確的折疊方向反應，這難道不可以理解成間接的催化肽鏈的折疊嗎?從表觀上看，抑制不正確的折疊途徑等于加快了正確反應的速度。所以，我本人也很贊成他們的觀點。最近的試驗已經為這一假說提供了很好的證據。PDI明顯抑制變性的甘油醛-3-磷酸脫氫酶在復性股過程中的嚴重聚合，有效的提高它的復性效率，與典型的分子伴侶GroE系統對甘油醛3-磷酸脫氫酶復性的效應極其相似。
五、分子伴侶的結構
目前唯一解出晶體結構的分子伴侶是E.coli的PapD，幫助鞭毛蛋白折疊的分子伴侶。還有HSP70的N端結構域，即ATP結合域也以有晶體結構。用電子顯微鏡已經清楚的看到了GroEL的十四聚體和GroEL的七聚體的四級結構， 象兩個圓形中空的面包圈疊在一起，用NMR以及各種溶液構象變化是研究分子伴侶作用機制的有效手段。
六、分子伴侶研究的實際應用
分子伴侶的研究成果必然會大大加深我們對生命現象的認識，同時也一定會增加我們與自然斗爭的能力和自身生存的能力。由于分子伴侶在生命活動的各個層次都具有重要作用，它的突變和損傷也必定會引起疾病，因此可以期望運用分子伴侶的知識來治療所謂的”分子伴侶病”。另一方面，利用對分子伴侶的研究成果從根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必將對大幅度提高人類生活水平起重要作用。
[ 參 考 書 目]
1. 李寶健 主編，面向21世紀生命科學發展前沿， 廣東科技出版社，1996年11月第一版：93-104頁
2．郝柏林 劉寄星 主編，理論物理與生命科學，上海科學技術出版社，1997年12月第一版：29-58頁
3．中國生物物理代表團，從第十三屆國際生物物理大會看生物物理學研究的現狀和趨勢， 生物物理學報，1999年 第十五卷 第四期：826-827 頁
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