超氧化物歧化酶的活性測定
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，簡稱 SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)的含Cu、Zn、Mn、Fe的金屬類酶。它作為生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(O 2 - )是人體氧代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)過量積累會引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內(nèi)許多疾病的發(fā)生和形成有關(guān)。由于SOD能專一消除超氧陰離子(O 2 - )而起到保護細胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應(yīng)用前景，并引起了國內(nèi)外醫(yī)藥界、生物界和食品界的極大關(guān)注。
按金屬輔基成分的不同可分成3種類型。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD)，主要存在于真核細胞的細胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量約為3.2×10 4 ，純品呈藍綠色，每個酶分子由2個亞基通過非共價鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中，在植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-S0D，過去一直認為只存在于原核細胞中，近來發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數(shù)情況下每一個二聚體中含有一個Fe原子。
[原理]
SOD的活力測定方法很多，常見的有化學(xué)法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有色中間物和O2 -，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學(xué)擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。化學(xué)發(fā)光法和光化學(xué)擴增法不適用于測定Mn-SOD，但對于Cu/Zn-SOD反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊 儀器 ，實際應(yīng)用受到限制。亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結(jié)合，應(yīng)用于Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數(shù)倍，而且專一性強，重復(fù)性好，操作方便，不需要特殊 儀器 和設(shè)備，易于實際應(yīng)用和推廣，是目前較好的測定方法之一。
在一般情況下，SOD酶活性測定只能應(yīng)用間接活性測定法。本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法。
鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O 2 - ，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長出有強烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時，由于它能催化O 2 - 與H+結(jié)合生成O 2 和H 2 O 2 ，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。
酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。
[ 試劑 和器材]
1、 試劑
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
稱取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右，用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L鄰苯三酚
稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD樣液
2、器材
（1）恒溫水浴槽
（2）紫外分光光度計
（3） 試管 、刻度吸管、微量注射器
[方法和步驟]
1、鄰苯三酚自氧化速率的測定
取兩支 試管 按下表加入25℃預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
試劑 | 空白管（mL） | 自氧化管（mL） |
pH8.2、50mmol/L | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
2、SOD樣液的活性測定
樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預(yù)熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。
試劑 | 空白管（mL） | 樣品管（mL） |
pH8.2、50mmol/L | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | - |
SOD樣液 | - | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
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