葡聚糖凝膠過濾法測定蛋白質分子量方法
實驗原理
葡聚糖凝膠(Sephadex)過濾法測定蛋白質分子 量的原理，主要是依據這種凝膠具有分子篩作用，一定型號的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。在一定的凝膠柱內，凝膠孔隙所占的體積稱為內水容積Vi，凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱為外水容積V0。當樣品流經凝膠柱時，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內部，只需V0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端；相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要V0+Vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗脫到另一端。中等分子(分子大小在上述兩種極限之間)所需洗脫液體積介于兩者之間，Ve=V0+KdVi(0<1)，如圖4.1所示。< p=""> <1)，如圖4.1所示。<>
Kd為分配系數，它表示一種物質在孔隙內的滲透程度，相當于這種物質在孔隙內所占體積和孔隙總體積的比值。
如果假定蛋白質分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子 量的蛋白質，進入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當蛋白質分子量在10000～15000時，蛋白質在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對數呈直線關系。若用已知分子量的標準蛋白質在一定型號葡聚糖凝膠柱上層析，精確測其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對分子量的對數logMW作圖，可獲得一條標準曲線(見圖4.2)。未知分子量的蛋白質在相同條件下層析，根據其洗脫體積即可在標準曲線上求得分子量。
圖 4.2三個不同大小分子 組份上柱洗脫曲線示意圖
本方法測分子 量設備簡單，結果處理方便，因此應用較廣泛。但本方法僅適用于軸比相近似為球狀蛋白，對軸比大的纖維蛋白不適用；對含量大于5%的糖蛋白因有較大水合作用，測得分子量偏高；對含鐵蛋白測定數據偏低。
圖4.3Ve 對log MW作圖
由于Ve與柱的大小有關，如果用Ve/V0對logMW作圖，同樣可得一線性關系的標準曲線，且可消除柱的大小和吸附效應的誤差(見圖4.3)。
1. 細胞色素c 2. 核糖核酸酶 3. 肌紅蛋白 4. α-胰凝乳蛋白酶 5. 胰蛋白酶 6. 胃蛋白酶 7. 過氧化物酶 8. 卵清蛋白 9. 血清白蛋白 10. 鐵蛋白
圖4.4 Ve / V0對log MW作圖
試劑和器材
一、試劑洗脫液：0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，0.1M KCl溶液：稱取12.12g Tris，15g KCl，先用少量去離子水溶解，再加入6.67mL濃HCl，用去離子水定容至2L。
藍色葡聚糖2000；Sephsdex G-100；N-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液(以洗脫液飽和)。
二、材料
牛血清白蛋白(Mr 67 000)；卵清蛋白(Mr 43 000)；胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)；細胞色素c(Mr 12 800)。
三、儀器層析柱；恒壓洗脫瓶； 紫外檢測儀或紫外分光光度計；自動分部收集器。
操作方法
一、溶脹凝膠
取Sephadex G-100 15g，加200mL蒸餾水，沸水浴中溶脹5小時。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細顆粒，然后再放些蒸餾水攪亂，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無細顆粒為止。溶脹平衡和漂洗凈的凝膠經減壓抽氣除去氣泡，即可準備裝柱。
二、裝柱
層析柱必須粗細均勻，柱管大小可根據試劑需要選擇。一般柱直徑(內徑)為1cm, 如果樣品量比較多，最好用直徑2 ~ 3cm的柱。通常柱愈長，分離效果愈好，但柱過長，實驗時間長而且樣品稀釋度大，易擴散，反而分離效果不好。當用作脫鹽時，柱高度為50cm比較合適；在進行分級分離時，100cm高度就夠了。
裝柱時，將柱垂直至于鐵架上。在柱中加約1/3柱容積的洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的出口關閉。把已經溶脹好的凝膠調成薄漿，傾入柱內，膠粒逐漸擴散下沉。當沉積的膠床至2～3cm高時，打開柱的出口，并注意控制操作壓以均勻不變的流速直到膠裝完為止。柱裝好后，在床的上面蓋上一張大小略小與柱內徑的濾紙片，以防止樣品中一些不溶物質混入床中和加樣時凝膠被沖起。再以洗脫液平衡柱層，直至層析的膠床高不變為止。柱裝得是否均勻，可用藍色葡聚糖上柱檢驗；如果色帶均勻下移，說明柱子已裝好，可以使用。
三、上樣
稱取0.5mg藍色葡聚糖2000(分子量200萬以上)四份，分別放在稱量瓶中，再稱取標準蛋白牛血清白蛋白(Mr 67 000)；卵清蛋白(Mr 43 000)；胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)；細胞色素c(Mr 12 800)各10mg，分別放在各稱量瓶中；各瓶加入N-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液0.5mL，使混合物溶解后分別上柱。
樣品上柱是實驗成敗的關鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會使區帶擴散，影響層析效果。上樣時應盡量保持床面的穩定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時，關閉出口，用滴管將樣品慢慢地加至柱床表面，打開出口并開始計算流出體積，當樣品滲入床中接近床表面1mm時關閉出口，同加樣品時一樣小心地加入少量洗脫液，再打開柱的出口，使床表面的樣品也全部滲入柱內。這時樣品已加好，在床的表面再小心地加洗脫液，使高出床表面3～5cm。
四、收集和鑒定
層析開始，在柱的出口處以試管分管收集流出液，流速為0.4mL/min, 4mL/管，收集液在280nm處測OD值。最高的一個OD值時的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。當N-乙酰酪氨酸乙酯洗脫峰出現后(此峰洗脫體積不必記錄)；按同樣的方法進行第二個標準蛋白質樣品的上柱，操作方法和步驟同前。
將各標準蛋白質測得的洗脫體積Ve對它們的分子量對數作圖，則應獲得一線性的標準曲線。
注意事項
(1)根據層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后住床容積，計算所需凝膠干粉的重量，以將用作洗脫劑的溶液使其充分溶脹。
(2)層析柱粗細必須均勻，柱管大小可根據試劑需要選擇。一般來說，細長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內徑太小時，會發生“管壁效應”，即柱管中心部分的組份移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
對于脫鹽的柱一般都是短而粗，柱長(L)/直徑(D)<10；對分級分離用的柱，L/D值可以比較大，對很難分離的組份可以達到L/D=100，一般選用內徑為1cm，柱長100cm就夠了。
(3)裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導致層析過程中，凝膠床高度下降。
(4)始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。
(5)用此方法測蛋白質的相對分子量，受蛋白質形狀的影響，并且測得的結果可能是聚合體的相對分子量，因而還需用電泳等方法進一步驗證相對分子量測定結果。
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