考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
[原理]
考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。
考馬斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。
蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。
[方法與步驟]
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取6支試管，按下表加入各 試劑 。
管號(hào) 試劑 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
100μg/ml牛血清白蛋白溶液／mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾水／mL | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
考馬斯亮藍(lán)液／mL | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄A 595 。
以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)、A 595 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品測(cè)定
試管 中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL ，再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄A 595 。
根據(jù)所測(cè)A 595 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。
注意事項(xiàng)
（1） 如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5～20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成。
（2） 測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于 比色杯 壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的 比色杯 洗干凈。
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