原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟
原位雜交組織(或細(xì)胞)化學(xué) (In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 簡(jiǎn)稱原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。
根據(jù)所用探針和靶 核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直接法 和間接法兩類。
直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間 接法一般用半抗原標(biāo)記探針，最后通過免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。
原位雜交最初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位 素標(biāo)記(如35S，3H，32P等)仍然廣泛使用，但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展(尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針)，更引起科技工作者的極大興趣。
一、基本要求
組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞最好在30min內(nèi)固定。
固定目的是：
(1)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
(2)最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；
(3)使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。
最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。
增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性：
(1) 稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理 后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過乙酰化而被阻斷。組織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2M HCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。
(2) 去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，最常應(yīng)用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會(huì)引起靶核酸的丟失。
(3) 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對(duì)靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)，還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
雜交緩沖液孵育：
雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤(180℃)以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：
雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交(包括檢測(cè)RNA時(shí))，雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。
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