膜蛋白分離方法
一、簡介：
1 細胞質膜資料
1895 年 ,Overton 從研究細胞透性得出 " 細胞膜由連續的脂類物質組成 " 。
1925 年 Gorter&Grendel: 用脂單分子膜技術測定細胞膜中脂分子的總面積，提出： " 細胞膜是由雙層脂分子組成 " 。
1935 年 Danielli&Davson ：從測定膜的表面張力得出細胞膜的 " 三明治結構模型 " ，即蛋白質－脂 - 蛋白質。
1959 年 Robertson: 用電鏡觀察生物膜提出 " 單位膜模型 " ，將膜的分子結構與超微機構統一起來
厚度： 2( 暗 ) 3.5( 亮 ) 2 （暗） =7.5
細胞質膜的主要功能概括如下：
(1) 為細胞的生命活動提供相對穩定的內環境 ;
(2) 選擇性的物質運輸，包括代謝底物的輸入與代謝產物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；
(3) 提供細胞識別位點，并完成細胞內外信息跨膜傳遞；
(4) 為多種酶提供結合位點，使酶促反應高效而有序地進行；
(5) 介導細胞與細胞、細胞與基質之間的連接 ;
質膜參與形成具有不同功能的細胞表面特化結構。
2 膜蛋白
雖動物細胞主要有 9 種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數膜蛋白分子數目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學功能。
根據膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內在膜蛋白。
(1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質分子或脂分子結合，因此只要改變溶液的離子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結構并不被破壞。
(2) 內在膜蛋白與膜結合非常緊密，一般講只有用去垢劑 (detergent) 使膜解后才可分離出來。
獲得大量有生物學活性的質膜蛋白對我們顯得非常的重要。
附注：使用分級抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，仍然是蛋白組學的一個瓶頸，不管采用２－Ｄ技術也好，ＩＣＡＴ乃至 proein microarray 都還不能有效解決這一問題。
二、蛋白抽提
談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化。
由于蛋白質種類繁多，不同的蛋白質由于結構和組成的差異，其溶解度也各不相同 . 根據蛋白質的溶解特性，同時可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機溶劑提取 .
但是針對膜蛋白的提取與細胞質蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。
膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當的增溶用表面活性劑，一般常用的有膽酸鹽， CHAPS( 一種離子去污劑）， Emulgen 和 Lubrol 等表面活性劑。
1 、分離膜蛋白的方法（原則性）：
1 ） 先分離膜，然后提取；如選用冷熱交替法、反復凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。
（例如： michael11 液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。
差速離心。蔗糖密度梯度離心。
收集 37% 與 41% 間的成分，即為質膜部分。裂解即可收集膜蛋白 ）
2 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。
從膜上提取蛋白有許多困難 . 在多數情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結構中溶解下來，然后將蛋白質穩定 .
去垢劑的選擇通常是依據他對所需要蛋白質的提取效率來確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟 .
雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑 .
這常常會引起蛋白質失活，但如果蛋白質是用于測序的，他將不是一個問題 .
如果不是用于測序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠 .
許多文獻和生化試劑供應商的產品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑 .
然而，他們并不是普遍適用的 . 在設計膜蛋白溶解方案時，必須考慮某一去垢劑的特殊性質 . 如 triton X-100 在 280nm 處有吸收，如果某蛋白質的測試與 280nm 處的吸收有關，就應避免使用這類去垢劑 .
將膜制劑與胞質蛋白及細胞核分離后，再進一步從細胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來 .
這種做法的好處是可以用強烈的去垢劑提取細胞骨架的相關蛋白，而無需考慮胞質蛋白、細胞核成分或染色質成分的混入 .
使用這種方法所獲得的膜蛋白，無論在種類上還是數量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ <5000Da ）要多 .
一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足 0.1% ，所以充分的膜蛋白的提取，無疑對于研究膜蛋白的結構和功能都是非常重要的 .
第二種方法簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。
一般的都是利用 4 度時所有的蛋白質原則上都溶于 TritonX114 水溶液，在溫度超過 20 度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質可提取膜蛋白。
3 ) 膜蛋白色譜 (Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP 分離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如 SDS ）溶解膜蛋白后形成 SDS- 融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。
羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（ P- 端），又具有陽離子鈣（ C- 端），與固定相結合主要決定于膜蛋白的大小、 SDS 結合量有關。
利用原子散射法研究 cAMP 的分離機制發現，樣品與 SDS 結合后在離子交換柱上存在 SDS 分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
4) 順序抽提法：根據細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。
用 Tris 堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用標準液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal protein extraction
原理：高滲的蛋白裂解液讓細胞溶漲破裂后，超高速離心
評價：盡管分級 ( 胞漿和胞膜 ) 之間有清洗的步驟 , 但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復的點 .
該方法相較 MOLLOY MP 教授在 1998 年 electrophoresis 上發表的分級抽提法減去了第一步 ( 用 tris 抽提水溶性蛋白 ) 和最后一步 ( 極難溶蛋白 ), 在操作上也作了簡化 , 總而言之是一種不錯的方法。（ codegreen ）
6)detergent- based ：提取時先裂解液裂胞膜（選用不同的去污試劑是關鍵），梯度離心分離細胞器 (ER) ，然后分級抽提方法。
例如，去掉細胞器之后的 DEBRIS 就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時不溶的部分。
總的感受：細胞的量要很充足。
之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。
純化蛋白質濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。
到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學的一個瓶頸。
2 、分離膜蛋白的方法（操作）
1）分離細胞膜蛋白的方法：
1、冰上刮下細胞后將細胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 A 中，于室溫與液氮罐中反復凍融 2 次。
2、5000 轉 4 度離心，驅除核及未裂解的細胞。
3、取上清 12000 轉 4 度離心 10 分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 B 中。
4、12000 轉 4 度離心 10 分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 C 中提取后測蛋白濃度 ,SDS-PAGE 電泳，分裝后 -20 度保存備用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2 ）分離細胞膜蛋白的方法：
1 、細胞放在冰上，去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
2 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min
3 、刮下單層細胞， 4 度下 10 000g 5min 離心
4 、溶液 37 度水浴 10min 以分離水相和去污劑相，然后 37 度下 2 000g 離心 5min
5 、收集水相留作分析
6 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min 后加溫，在按步驟 6 再次離心
7 、按步驟 8 再次抽提去污劑相，用 buffer C 將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
8 、用等量的 buffer A 分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗
試劑：
1 、 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制劑
2 、緩沖液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）
3 、 buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3 ）分離細胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000 個細胞，可用此 buffer 1ml 。 冰浴勻漿。冰上置 30 分鐘。
4 度高速低溫離心 30min 。
取上清 -20 保存。
4 ）分離組織膜蛋白的方法：
1 、取組織，加入 10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。
2 、 J6-HC 離心機 800rpm ， 4 ℃離心 10min 后，所得上清液轉入超速離心管。
3 、 100000g ， 4 ℃離心 1hr 。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B 重懸，冰上孵育 2hr 后分裝至 EP 管， Eppendorf 臺式離心機 10000rpm ， 4 ℃離心 30min 。
4 、收集所得上清液即為膜組份。
Buffer A ： 0.32M 蔗糖， 5mM Tris-HCl （ PH 7.5 ）， 120mM KCl ， 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上預冷。
Buffer B ： 20mM HEPES （ PH 7.5 ）， 10% 甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。 冰上預冷。
5 ）分離組織膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5 去氧膽酸鈉
0.1%SDS
以下用時加入
10mg/ml PMSF 異丙醇（終濃度 10ul/ml ）
Aprotinin （ 30ul/ml ）
1000mM Sodium Orthovandate （ 10ul/ml ）
冰凍組織 100mg/ 細胞 1000000 個，可用 RIPA buffer 1ml 。 冰浴勻漿。冰上置 30 分鐘。
4 度高速離心 30min ， 20000 轉低溫離心最佳。
取上清 -20 保存。
6 ）分離細菌膜蛋白的方法：
1、于 20ml 營養肉湯中過夜培養細菌， 37 ℃， 200rpm 。
2、10000g 、 20min 、 4 ℃離心，去上清。
3、20ml 預冷的 Tris-Mg 緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預冷的 Tris-Mg 緩沖液。
④ 超聲波破碎細菌。
⑤ 3000g ， 10min 、室溫下離心去除未破碎細菌。小心吸取上清（含有胞質成分和細菌外被成分）。
⑥ 超速離心 I ： 100,000g ， 60min ， 4 ℃，去除上清（胞質成分），收集細菌外被成分。
⑦ 用 10ml 含 2 ％的 SLS 的 Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育 20-30min 。
⑧ 超速離心 II ： 70,000g ， 60min ，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質膜）。重復⑦、⑧兩步。
⑨ 充分吸除上清，并根據沉淀體積大小用 0.1-0.2 ml 的 ddH2O 重懸沉淀物。根據公式：蛋白濃度 (mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260 測定外膜蛋白濃度，調節蛋白濃度至 40ug/ul ，該蛋白質樣品 -70 ℃貯存。
試劑
① Tris-Mg 緩沖液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3 ， 4 ℃保存
② 2%(w/v) 十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)
7 ）來源于 Methods Enzymology (1974)
1、 取一定量酶處理的細胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應，因此要精確掌握分離介質中的離心強度和滲透壓，以每克細胞濕重加 40ml 介質。
2 、用 Potter-Elvehiem 勻漿器，桿與壁間間隙 0.5 ～ 0.6 μ m,14.4kr/min 上下勻漿 4 ～ 6 次，每次 5S 。
3、過濾勻漿液， 150g 離心 10min ，保留上清，沉淀部分加入 50 μ l 介質，用勻漿器 1kr/min 勻漿 3 次， 150g 離心 10min ，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4、合并 3 次上清液， 2kg 離心 10min ，棄上清，沉淀部分溶于 100 μ l 介質，離心 10min ，棄上清，留沉淀。
5、將沉淀部分加入 70% 蔗糖 15 份，然后分別置于三個離心管中，上面依次疊加 54% 、 49% 、 45% ， 41% ， 37% 蔗糖溶液各 2 、 2 、 5 、 5 、 3 份。
6、 700kg 離心 90min ，分離介質在 1.16 ～ 1.18 之間形成介面。
7、收集 d 為 1.16 ～ 1.18g/ml 之間的細胞膜，加 30 倍的介質以 2.5kg 離心 10min ，洗滌 2 次。
8、保存于 2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5 緩沖液中，用于細胞膜的研究分析
8 ）常用的制備粗制質膜組分的方法：（所有操作都在 4 攝氏度下進行）
1. 在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復上述操作，直至組織碎成 1mm3 大小的碎片，且無可見的血。
2. 加入 5 倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的 Dounce 氏玻璃勻漿器中，抽研 10-20 次，勻漿組織。
3. 勻漿 4 攝氏度 600g 離心 10min ，上清含細胞膜、線粒體和細胞溶膠。沉淀中有未破碎的細胞及細胞核。棄沉淀。
4. 上清 4 攝氏度 8000g 離心 10min ，沉淀線粒體。棄沉淀。
5. 上清 4 攝氏度 10000g 離心 20min ，棄上清。
6. 用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續勻漿，再次 4 攝氏度， 10000g 離心 20min ，棄上清。
7. 用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。
8. 粗制的樣品可于干冰 / 乙醇中速凍，保存于 -80 攝氏度。
9 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。
簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。
原理： 4 度時所有的蛋白質原則上都溶于 TritonX114 水溶液，但在 37 度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。
方案
1 、放射性標記受試細胞
2 、將標記的細胞放在冰上
3 、去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
4 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min
5 、刮下單層細胞， 4 度下 10 000g 5min 離心
6 、溶液 37 度水浴 10min 以分離水相和去污劑相，然后 37 度下 2 000g 離心 5min
7 、收集水相留作分析
8 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min 后加溫，在按步驟 6 再次離心
9 、按步驟 8 再次抽提去污劑相，用 buffer C 將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
10 、用等量的 buffer A 分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗
試劑：
1 ） 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制劑
2 ）緩沖液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）
3 ） buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
10 ）植物中：高度純化的質膜是質膜蛋白研究的基礎，制備純化方法也很多，植物材料中以
1、蔗糖密度梯度離心、
2、水溶性雙水相法、
3、自由流電泳等方法為主。
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