Western Blot(免疫印跡法)實(shí)驗(yàn)方法步驟
Western Blot( 免疫印跡法 )
主要包括以下 4 個(gè)基本步驟：
n 樣品制備
n 電泳分離
n 蛋白的膜轉(zhuǎn)移
n 免疫雜交與顯色 蛋白檢測
溶液和試劑
n 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)
n Modified RIPA buffer
Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM
n 1X SDS 樣品緩沖液
62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚藍(lán)
n 轉(zhuǎn)移緩沖液
25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)
n 10X Tris緩沖鹽 (TBS)
準(zhǔn)備1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl調(diào)pH為 7.6
n 脫脂奶粉或BSA
n 甲醇
n TBS/T緩沖液
1X TBS, 0.1% Tween-20
n 封閉緩沖液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脫脂奶粉或BSA
n 一抗的稀釋
1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脫脂奶粉(單抗)
Note: 一般來說, BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比?？贵w的稀釋度參考抗體說明書或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。
n 預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率
樣品制備
原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
1．培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
2．棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。
3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意： 冰上操作。
4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5．煮沸樣品5 minutes。
6．離心12000g, 5 min，取上清。
7．電泳分離：上樣15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。
如要定量檢測某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。
注意： 一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測方法。
電泳分離（參照 SDS-PAGE 電泳方法）
轉(zhuǎn)膜
雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。
蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。
1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。
注意： 如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。
2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。
3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。
4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。
5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜
免疫雜交與顯色
1． 用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。
2． 置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。
3． 15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4． 加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。
5． 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6． 加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。
7． 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
8． 15 ml TBS洗1次。
9． 蛋白檢測(顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說明操作)。
注意事項(xiàng)：
1．操作中戴手套，不要用手觸膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過5秒。
3．如檢測小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。
4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。
5．關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。
6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。
如要同時(shí)檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。
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