大腸桿菌抽取RNA

之前已分別構筑出GUS 基因的表現質體pQG11,若要令啟動子T5promotor 的啟動受到更好的調控，應進一步將pQG11 轉形至大腸桿菌M15[pREP4]. M15[pREP4] 可持續表現lac repressor,pQG11 上用以驅動GUS基因表現的T5 promoter 的活性將因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能誘導GUS基因大量表現。

在這一節的實驗里，我們將分別自經IPTG 誘導與未經誘導的pQG11/M15[pREP4] 菌體抽取total RNA,以便以北方雜合反應分析GUS mRNA的表現情形。 下面所采用的方法適用于大腸桿菌及其他革蘭氏陰性菌total RNA的抽取，實驗進行時先以lysozyme 分解細胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）裂解原生質膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入適量的氯化鈉溶液將SDS、蛋白質及大腸桿菌的染色體DNA 一并沉淀下來，并以離心法移除，存留于上清液的RNA 則以酒精沉淀。 實驗過程所使用的RNase 抑制劑為DEPC.

儀器用具：恒溫震蕩培養箱37℃；冰浴；微量離心機；分光光度計 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）

藥品試劑：大腸桿菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培養液；Ampicillin （100 mg/mL）；Kanamycin （25 mg/mL）；IPTG （1 M）；Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）；Lysozyme （50 mg/mL）；Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl； 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）；Diethylpyrocarbonate （DEPC）；飽和氯化鈉溶液 （以40 g氯化鈉溶解于100 mL dH2O/DEPC）；絕對酒精及70%酒精

方法步驟：

大腸桿菌pQG11/M15[pREP4] 的培養：

1） 將pQG11/M15[pREP4] 接種于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培養液，于37℃震蕩培養過夜。

2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 過夜培養液，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 與kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培養液，于37℃震蕩培養2 h。

3） 加入25 μL 1 M IPTG，繼續放置于37℃震蕩培養。

4） 經過4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培養液，開始進行RNA 制備工作。

制備RNA：注意！進行以下RNA 制備實驗時，除了使用依上述步驟所準備的pQG11/M15[pREP4] 培養液外，請記得向助教領取未經IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養液當做對照組。

1） 取出4 支1.5 mL 微量離心管，分別標示為I-1, I-2, U-1 與U-2。

2） 取3 mL 經IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養液平均分置于微量離心管I-1 與I-2。

3） 取3 mL 未經IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養液平均分置于微量離心管U-1 與U-2。