慢病毒使用操作手冊
一、慢病毒的儲存與稀釋:
1. 病毒的儲存：收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實驗，可以將病毒暫時放置于4 ℃保存；如需長期保存請放置于-80℃（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）
① 病毒可以存放于-80℃ 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前需要重新滴定病毒滴度。
② 反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融,建議收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。
2. 病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細(xì)胞用PBS或無血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)。混勻分裝后4℃保存(請盡量在三天內(nèi)用完) 分裝后使用。
二、慢病毒用于體外（In Vitro）實驗：
感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞。慢病毒對各種細(xì)胞和組織的親嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（MOI 值）以及在體（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實驗得到合適的感染復(fù)數(shù)（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性）。
慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗
1. 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗注意事項：
① 測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞(HEK293T，Hela）作為平行實驗的對照細(xì)胞。
② 在進(jìn)行慢病毒感染實驗時，可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。
③ 一般慢病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。
2. 以24孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞的感染預(yù)實驗實驗前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。
第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種3~5X104個目的細(xì)胞，鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 μl；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%左右。
第二天，準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實驗室的實際情況將按照MOI準(zhǔn)確計算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。
第二天，感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，首先察細(xì)胞生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實驗。
a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基。
b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生長良好，密度適宜，則不用換液）。
c在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計算好的病毒液。
d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）孵育過夜。
注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中。慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，通過提高M(jìn)OI 值可以提高病毒的感染效率，但是當(dāng)MOI高于20時，我們建議在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）來提高病毒的感染效率。
第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。
第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計慢病毒感染目的細(xì)胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。
注意：
有些慢病毒載體上帶有GFP 綠色熒光蛋白，使用者可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對目的細(xì)胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFP\BFP可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達(dá)的情況。
慢病毒表達(dá)時間較慢，熒光表達(dá)所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達(dá)。
感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達(dá)時間和表達(dá)強(qiáng)度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。感染期間請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
三、慢病毒使用安全使用規(guī)范
慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險，不建議使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實驗。使用時請參照如下所示進(jìn)行實驗：
1．病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風(fēng)機(jī)。
2．病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。
3．操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。
4．用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。
5．如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。
6．脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。
