RNA甲醛變性膠電泳

提取樣品的總RNA后，一般根據(jù)RNA的凝膠電泳圖來判斷RNA的質(zhì)量。由于RNA容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此常用甲醛變性膠來進(jìn)行RNA電泳，得到的電泳圖能真實(shí)反映RNA的質(zhì)量狀況。

一、試劑：

DEPC（Sigma公司產(chǎn)品），MOPs（Bocherigmer公司產(chǎn)品），甲酰胺（Formamide，Sigma公司產(chǎn)品），溴酚藍(lán)（Bromphenol Blue，Sigma公司產(chǎn)品）。EDTA-Na2，氫氧化鈉，醋酸鈉，甲醛，甘油，分析純，國(guó)產(chǎn)。

二、試劑配制：

1、DEPC 水的處理：用量筒量取去離子水2L，在通風(fēng)櫥中，加入2ml DEPC到2升去離子水中，終濃度為0.1%的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然后放在搖床中中速搖蕩至少4hr，再高壓滅菌。滅菌時(shí)將瓶蓋松開，15磅滅菌20min。

2、10 × FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA）：配制500ml，稱取3.4g NaAC?3H2O放入1000ml燒杯中，加入400ml DEPC 處理過的去離子水，加入攪拌子，放在磁力攪拌器上溶解。然后加入20.9g MOPs，放在磁力攪拌器上溶解。再加1.86g EDTA二水二鈉，放在磁力攪拌器上溶解。用1M滅過菌的NaOH 調(diào)PH至7.0（約用NaOH 40ml），用DEPC 處理過的去離子水定容至500ml，裝入棕色瓶中，寫好標(biāo)簽，室溫避光保存。

4、5 × 甲醛變性膠加樣緩沖液（5×loading buffer）： 配制10ml。預(yù)先配制水飽和的溴酚藍(lán)溶液：在1.5ml 離心管中加入約0.1mg溴酚藍(lán)，加入1ml DEPC水溶解，充分振蕩溶解，離心，可見離心管底部有溴酚藍(lán)粉末剩余，上層液體即水飽和的溴酚藍(lán)液。在15ml滅菌離心管中，依次加入以下各種成分：
4.0ml 10 × FA buffer

3.1ml 甲酰胺
2.0ml 100%的甘油
720ul 37%的甲醛
80ul0.5M的 EDTA （PH 8.0）
16ul 水飽和的溴酚藍(lán)
100ul DEPC水
混勻，分裝，-20℃保存，常用放4℃保存。

5、1×甲醛變性膠電泳緩沖液（1×running buffer）：20 ml 10×FA gel buffer，4.0 ml 37%的甲醛，176 ml水，放入電泳槽中使用，一般在3次電泳結(jié)束后需更換此電泳緩沖液。

6、1.2%的甲醛變性膠：稱0.4克瓊脂糖，加入3.34 ml 10×FA gel buffer，加入30 ml DEPC水，微波爐融化，肉眼觀察無顆粒狀懸浮物。冷卻至約50-60℃，再加入600 l甲醛，倒入7.5×5.0 cm的凝膠模具中。插入合適長(zhǎng)度和寬度的梳子，室溫放置約30min后即可使用。

三、實(shí)驗(yàn)方法

一般取0.3 g的總RNA，加入1/5體積的5×加樣緩沖液，65℃加熱5 min，冰上驟冷，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。建議上樣前在RNA樣品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙錠（EtBr，濃度1.0 mg/mL），而不在膠中加EtBr，這樣電泳后的背景較低。配好的1.2%的甲醛變性膠先在1×甲醛變性膠電泳緩沖液中預(yù)電泳15min。RNA樣品在5-10 V/cm的電壓降下電泳30min。圖1是我們實(shí)驗(yàn)室用以上方法檢測(cè)酵母總RNA的電泳圖。

圖1 酵母total RNA的甲醛變性膠電泳。1，酵母total RNA（0.3 g）；2，酵母total RNA（0.5 g）；3，RNA Marker（0.2 g）。RNA的質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)是有清晰的26S，18S條帶，無降解，且肉眼觀察26S條帶亮度約是18S的1-2倍。