RNA的提取和cDNA合成原理和實驗方法
第一節 概 述
從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。
總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。
一、RNA制備
模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。
所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。
凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。
試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。
配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經硅烷化處理。
細胞內總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。
分離的總RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
二、cDNA第一鏈的合成
所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。
AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。
MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。
AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。
AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3'端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。
三、cDNA第二鏈的合成
cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:
(1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 5'端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。
(2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。
該反應有3個主要優點:
(1) 非常有效;
(2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化;
(3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。目前合成cDNA常采用該方法。
四、cDNA的分子克隆
已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增后再克隆入適當載體。
第二節 動植物組織mRNA提取
一、材料
水稻葉片或小鼠肝組織。
二、設備
研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。
三、試劑
1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。
3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS
4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步驟
（一）動植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。
3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。
3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。
5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。
7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30分鐘。
8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。
9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
[注意]
1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
第三節 植物病毒RNA提取
大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。
一、材料
提純TMV病毒液（10mg/ml）。
二、設備
冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。
三、試劑
TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。
四、操作步驟
1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。
2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。
3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12000g離心10分鐘。
4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。
6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7、取10ml進行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。
[注意]
1、整個操作應盡可能在低溫下進行。
2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。
第四節 cDNA合成技術
一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技術
Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系統采用M-MLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶,使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進行置換合成,最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端,方法簡便易行。該系統試劑包括：
20μg 特異性引物
200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃時); 375mmol/l KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA酶抑制劑
10,000μ M-MLV反轉錄酶, RNase H-
5μg 對照RNA
400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl
30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
500μ RNase H
500μ DNA聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
2×1.25ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。
（一） 第一鏈合成
1. 試劑
[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。
2. 操作步驟
(1) 取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和適當引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O調整體積至15μl, 70℃處理5分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入
5×第一鏈緩沖液 5μl
rRNasin RNA酶抑制劑 25U
M-MLV(H- )反轉錄酶 200U
H2 O 調至總體積25μl
(2) 用手指輕彈管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時
(4) 取出置于冰上
(5) 摻入測定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應,并使總體積為100μl。可取90μl進行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl進行同位素摻入放射性活性測定。
第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成
注：以上25μl反應總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴大反應體積, 倒5μg RNA使用125μl總體積進行合成。
（二） 第二鏈合成
1、 取第一鏈反應液 20μl, 再依次加入
10×第二鏈緩沖液 20μl
DNA聚合酶Ⅰ 23μ
RNase H 0.8μ
H2O 加至終體積為100μl
2、輕輕混勻,如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA, 則需延長至3-4小時)。
4、 摻入測定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl進行同位素摻入放射性測定,余下的可進行電泳分析。
5、 cDNA第二鏈合成離心管反應液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。
6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃溫浴10分鐘。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應。
8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應液,離心2分鐘。
9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分鐘后離心5分鐘。
10、 小心丟去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,離心2分鐘。
11、 小心移去上清液,干燥沉淀。
12、 沉淀溶于10-20μl TE緩沖液。
（三）同位素摻入放射性活性測定、計算和電泳分析
1. 試劑
1mg/ml鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍）。
2. 操作步驟
(1) 各取一2(5)中和二(4)反應液各3μl,點于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。
(2) 同樣各取3μl中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。
(3) 用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 這些樣品代表摻入放射性活性。
(4) 分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數。
3. 第一鏈產量測定
第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%
摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應體積(μl)×(第一鏈摻入率)
設330為每mol dNTP的平均分子量
合成cDNA量(ng)=摻入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA向cDNA轉變率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%
例如總放射性活性強度為254,000cpm, 摻入放射性活性強度為3040cpm, 所用RNA摸板量為1μg,反應體積為25μl, 則:
摻入率＝3040/254000×100%=1.2
摻入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA向cDNA轉變率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于摻入測定,而反應體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA合成量為0.8×198ng=158ng。
4. 第二鏈產量計算
除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產量計算
第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性??
摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反應體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率
第二鏈cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
雙鏈cDNA轉變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/ 單鏈cDNA合成量(ng)
例: 第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp, 總放射性活性強度為235000cpm.
第二鏈摻入率=2780/235000×100%=1.18%
第二鏈合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二鏈cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
雙鏈cDNA轉變率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA第一鏈轉變率和雙鏈轉變率以12-50%和50-200%為好。
（四） 電泳分析
通常合成的cDNA第一鏈和第二鏈長度為350-6000堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的9-12步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。
1. 標準分子量DNA參照物的同位素標記
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶進行32 P標記
10×HindⅢ緩沖液 2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ標準DNA 1μg
Klenow DNA聚合酶 1μ
加H2O 到總體積25μl
(2) 室溫放置10分鐘, 加2.5μl 200mM EDTA終止反應, 加入2×樣品緩沖液,貯存于-20℃。
2. 電泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA制備1.4%的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30分鐘。
(2) 取樣品液, 用TE調整體積, 使第一鏈和第二鏈產率測定液的體積相同,加入等體積的2×樣品緩沖液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉蘭）。
(3) 加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。
(4) 將膠浸入7% TCA中,室溫放置30分鐘(直至染料由藍色變至黃色),取出置濾紙上,干燥數小時。
(5) 用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X光片(用增感屏時-70℃壓片)。
二、其它cDNA合成技術
除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技術外，Promega公司還提供有多個AMV合成試劑盒，不同試劑盒所提供的引物或引物一延接頭(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、隨機引物、XbaⅠ引物-延接頭、NotⅠ引物-延接頭等，其余試劑一樣，這些系統包括：
20mg 引物
20ml 5×第一鏈緩沖液, 配方如下：
250mmol/L Tris?Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
MgCl2; 2.5mmol/L 亞精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM焦碳酸鈉
625m rRNasin RNA酶抑制劑
600m AMV反轉錄酶
5mg 1.2kb對照RNA
200ml 10×第二鏈緩沖液，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
2m E.Coli RNaseH
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。
（一）第一鏈合成
下面介紹的是25ml體積反應系統，該系統可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反應體積10ml，如5mg mRNA需55ml反應體積。
引物或引物-延接頭和反轉錄酶與mRNA的比例應分別保持為0.5mg/mg（對NotⅠ引物-延接頭為0.3mg/mg）和15m/mg.
1、試劑：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE飽和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE緩沖液(10mM Tris?Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
2、操作步驟：
（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管加入的RNA樣品，及引物或引物-延接頭，用H2O調節0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5分鐘，待冷至室溫，離心數秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入：
5×第一鏈緩沖液 5ml
rRNasinR RNA酶抑制劑 25ml
40mM焦碳酸鈉2.5ml
AMV反轉錄酶 15m/mg RNA
加無水RNA酶水至總體積25ml
在加入焦碳酸鈉和AMV反轉錄酶前，需將反應液42℃溫浴5分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。焦碳酸鈉主要用于抑止第一鏈形成發夾結構。
（2）輕彈eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
（3）42℃溫浴1小時。
（4）取出置冰上。
（5）摻入測定的eppendorf管加入50mM EDTA，終止反應，并使總體積為100ml。可取90ml進行電泳分析，另10ml進行同位素摻入測定。
（6）第一鏈合成離心管可直接用于第二鏈合成。
（二）第二鏈合成
第二鏈合成可在第一鏈合成反應液中直接進行。
1、第一鏈反應液（20ml）中依次加入
10X 第二鏈緩沖液 10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m
加無核酸酶水至總體積 100ml
