病毒滴度的測定
稀釋計數(shù)法
滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)?！盩U”為”transducing units”的縮寫，中文為“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。
第一天 細(xì)胞準(zhǔn)備
將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，為每個病毒準(zhǔn)備10個孔。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
第二天 加病毒
在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備10個1.5ml EP管，每管加入90μl培養(yǎng)液，往第一個管中加入10μl病毒原液，混勻后，吸取10μl加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。
第三天 追加培養(yǎng)液
在每個孔再加入100μl完全培養(yǎng)液，利于細(xì)胞的生長。
第五天 觀察結(jié)果并計算滴度
在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl ）。
定量PCR法
病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個。
接種細(xì)胞24小時后，取兩個孔的細(xì)胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細(xì)胞的實際數(shù)目，記為N。
棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別加入0.5μl，5μl和50μl的稀釋病毒。
感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，換為500μl含DNaseI 的新鮮培養(yǎng)基。在37℃消化15分鐘，這一步是要除去殘余的質(zhì)粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量（Bio-Rad）?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20℃至少2個月。
準(zhǔn)備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管Ⅰ：
| Forward primer (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| Reverse primer (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| Probe (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| H2O | 19.7μl × n |
n = number of reactions。例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。震蕩后放在冰上。
| 2× TaqMan Master Mix | 25 μl × n |
| 10×RNaseP primer/probe mix | 2.5 μl × n |
| H2O | 17.5μl × n |
n = number of reactions。例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震蕩后放在冰上。
在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，從總管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照（no-template control）。
分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照（no-template control）。
所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃ 2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環(huán)。
數(shù)據(jù)分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。
滴度（integration units per ml，IU ml-1）的計算公式如下：
IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V
其中：C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)；N = 感染時細(xì)胞的數(shù)目（約為1×105）D = 病毒載體的稀釋倍數(shù) ；V = 加入的稀釋病毒的體積數(shù)。
