G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系PROTOCOL
1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。
2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。
3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。
4.加G418篩選: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。
5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。
6.確定最佳篩選濃度：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細(xì)胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。
通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。
a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)；
b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。
c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；
d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。
e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測目的基因是否存在。
常見問題：
1.轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？
無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。
2.neo基因和目的基因是不是一定會整合在一起？
整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用RT-PCR的方法進(jìn)一步鑒定。
培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧
體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長因子。這個(gè)過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：
適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制
a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液
b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液
c 慮過：再經(jīng)直徑0.22um濾器過濾，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩?/span>
