帶有GFP的質膜蛋白分選觀察

一、實驗目的 　
　　1.了解綠色熒光蛋白和共聚焦掃描顯微鏡在細胞分子 生物學中的應用
　　2.學會使用質膜蛋白的分析軟件。

二、帶GFP的質膜蛋白分選概述
1．質膜蛋白的跨膜信號
　　在粗面內質網 上合成的蛋白質有兩類：分泌蛋白和膜蛋白，分泌蛋白在內質網上合成之后通過多種信號切除后釋放到內質網的腔中，進行下游途徑的轉運。膜蛋白較為復雜，它要靠疏水區滯留在內質網膜上。下面以酵母二價鐵的轉運蛋白（IRT）為例來說明膜蛋白的轉運。IRT除了含有信號肽（也稱開始轉移序列 ‘start transfer sequence’是引導和啟動肽鏈穿過內質網膜的信號肽)以外，還有八個跨膜結構域，這里有一個定向問題，即羧基端和氨基端位于內質網的內側還是外側問題。經TMpred和TMHMM預測的IRT的跨膜螺旋結構域，發現它的羧基端和氨基端均位于質膜的外側。這樣推測IRT在粗面內質網共翻譯和轉運時，羧基端和氨基端均位于內質網的內側。推測IRT除了開始轉移序列外，還有四個內部起始轉移信號（internal signal sequence）啟動多肽鏈的轉移和四個終止轉移序列 (stope transfer sequence)。終止轉移序列可能有某些序列與內質網膜有很強的親和力，緊密結合在膜脂雙層中而不再轉入內質網腔中。內部起始序列和終止轉移序列都不被切除，整個多肽鏈作為穿膜八次的跨膜蛋白定位在膜中。
　　總結如下 ①一種多肽只有N端信號肽序列（或稱開始轉移序列）, 無停止序列T此蛋白合成后進入內質網腔中；②多肽的內部起始序列和終止轉移序列位于分子中部，而且不被切除T 跨膜蛋白；③含多個內部起始序列和多個終止轉移序列 T多次跨膜的膜蛋白。
2． GFP的特性
　　綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一種能夠自身催化形成發色結構，并在藍光或紫外光的激發下發出熒光的新型報告基因。GFP的發現及其研究迅速發展，使人們能夠在正常生活條件下對活細胞內分子水平上進行的各種過程及其分子機理進行觀察和研究。目前的研究表明，GFP能在多種生物，如細菌 ，酵母，植物及哺乳動物中表達且產生可見熒光,因此有著很高的應用價值。GFP之所以能產生綠色熒光是由于其蛋白分子多肽鏈內含有特殊的生色團結構，即第65-67位氨基酸Ser-Tyr-Gly鏈，它們可自身環化在氧氣的參與下與周圍其它三個氨基酸形成六肽生色團。晶體結構分析表明，GFP分子為致密管狀，由周圍11個β-折疊片圍繞中央一個α-螺旋構成，其生色團即包含在該中央α-螺旋結構中。GFP蛋白非常穩定，其光譜特性一般不受變性溶液的影響。
　　所以它用于生物技術的許多方面具備以下優點：
　　①GFP發出熒光不需要外加任何底物或共作用因子，僅用藍光或紫外光照射即可激發熒光，所以檢測非常方便，用顯微鏡、熒光計、熒光激活細胞分選儀等就可以實現。
　　②GFP熒光穩定且沒有物種特異性，在原核、酵母、植物以及動物細胞中都獲得了成功表達。
　　③GFP基因序列較短，可以與其它基因一起構建到載體上進行轉化而不致于因為質粒過大而影響轉化頻率。
　　④GFP基因的表達產物對生活細胞基本上沒有毒害作用，不會影響細胞的正常生長及功能。