人造血干細胞擴增的研究進展
progress on Study of Techniques for Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells
chem Yongle1,Ling Weijun2,Peng Dongxian 1(1.Zhujiang Hospital ,The First Military Military medical Uniuersity.Guangzhou 5102082 2.The 421 st Hosspital of PLA)
造血干細胞（llematopoietic stem cells,HSC）移植可能使遺傳血液病、免疫缺陷病及惡性腫瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴為獲得足夠量移植用HSC，必須進行大規模的骨髓抽吸或餐周血分離；⑵獲得的HSC量有限；⑶HSC輸注后產生的成熟細胞的生物動力欠佳，移植后1-3周內并無直接治療療效。移植前HSC培養擴增，可解決這些難題。當前主要有兩種：⑴細胞因子支持下篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質支持下的灌注培養。下面就HSC培養的發展、HSC擴增方法以及展望等作一綜述。
1 早期HSC培養及啟示
1半固體培養體系 1966年，Bradley等[1]介紹了一種新的半固體培養方法（即集落形成法）用以培養骨髓。此法利用膠體凝膠作支托，沒有細胞微環境，只能維持造血祖細胞在1-2周內形成細胞集落，不能支持HSC的生長或分化。即使沒法加入營養物、生長因子等，培養時間也只能延長到2-4周。由半固體培養體系的期限性可推斷，早期原始HSC不能在這樣的培養體系中存活、增殖。
2Dexter培養體系 Dexter等[2]于1977年建立了骨髓液體培養體系。此培養法基礎是建立一骨髓基質細胞支持層（包括成纖維細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、內皮細胞和網狀細胞等），形成二維空間結構，培養體系不單提供了營養、細胞因子，而且提供了類似于體內的細胞-細胞關系，使此法纖維造血8-12周[3]。極限稀釋法技術證明，在Dexter培養體系中，前造血祖細胞在培養第一周前已開始減少[4]。應用細胞免疫表型分析提示，該體系培養的骨髓CD34+、CD38-細胞不能更新復制[5]。早期造血細胞體外培養擴增方法的研究啟示：HSC細胞可在體外培養，但兩種培養方法均沒有建立適合其體外造血的微環境。尋求建立，一個合適的人HSC培養體系是研究的關鍵。
2 目前HSC的體外擴增方法
理想的SHC培養方法要求既能最大限度地擴增各階段的造血細胞，又能維持甚至擴增HSC。目前較為成功的人HSC體外擴增方法主要有兩種：⑴細胞因子支持十篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質支持下的灌注培養。
2.1 細胞因子支持下篩選CD34+細胞培養
2.1.1 HSC的特性 HSC沒有任何形態方面的特征，也沒有獨特的免疫表型迄今尚無直接檢測的方法。HSC只能通過脾結節形成法檢測，也可通過檢測高增殖潛能集落形成單位（CFU-HPP）長期培養啟動細胞（LTC-IC）反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123熒光呈陰性或低強度，對4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的細胞群體，早期的造血細胞大部分處于G0/G1期，啟動慢，但擴增持續時間長，擴增倍數高，造血細胞產量高。較成熟造血細胞啟動快，短期擴增倍數高，維持時間短，產物多是成熟細胞，造血祖細胞產量少。
2.1.2 細胞因子的造血調節根據細胞因子對造血細胞不同的作用階段將其分為：
⑴特異性細胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；
⑵無系特異性細胞因子：作用于分化狀態的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要維持處于G0期之外所有HSC的生存、增生；
⑶G0期作用細胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，維持早期HSC的存活或促其分化擴增：
⑷抑制血細胞生成的細胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特異性，TGF-β主要抑制早期血細胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖[6]。
2.1.3 擴增策略 目前細胞因子支持下篩選CD34+細胞體外擴增方法研究最為普遍。實驗證明，篩選早期HSC剔除成熟的CD34-細胞進行擴增，可獲得更好的效果[7]。單獨應用一個細胞因子擴增人HSC效果不佳，多個因子合理組合才能獲得理想的擴增效果。一般認為，生長因子合理組合應包括：
⑴抑制細胞殘死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等
⑵刺激早期造血細胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；
⑶定向擴增刺激因子，如G-CSF和EPO等[9]。
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Moore[10]用delta培養法培養骨髓CD34+細胞，發現未用因子時CFU-GM迅速消失；而單用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子時，14天培養CFU-GM維持不變或只擴增2-8倍；用SCF/IL-3聯用另3個或3個以上因子組合擴增效果更好。多數人認為合適的細胞因子組合為IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17擴增經動員外周血（MPB）CD34+細胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以擴增非MPBCD34+細胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]則認為SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最適于外周血CD34+細胞擴增，12-14天培養，擴增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而擴增臍血CD34+、CD45RA low、CD77low的CFU-GM（70倍）和BFU-E（55倍）的最好因子組合分別為SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，擴增兩者的最佳組合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分無IL-6R表達，IL-6/Sil-6R復合體激發HSC表達gp130，啟動HSC自我復制的信號傳遞，而c-Kit/SCF是HSC自我自制擴增的另一信號傳遞途徑。無血清條件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人臍血CD34+細胞，細胞總數和造血祖細胞數隨Sil-6R增加而明顯增加，培養14天，
CFU-GM擴增近70倍，集落中除了幾個CFU-M和BFU-E外，有大量（≥60%）的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情況下，培養7天，14天，分別擴增CFU-Mix60倍和70倍。由此說明，細胞因子促進造血是通過與期受體結合引起信號傳遞而起作用的，為體外造血研究開創了新的思路。
