電子顯微鏡生物標本的制備及觀察

【實驗目的】
了解電子顯微鏡 的基本原理及電鏡生物標本的制備方法和觀察。
【實驗用品】
一、材料和標本 家兔一只。
二、器材和儀器 H—600透射電子顯微鏡、S—450掃描電子顯微鏡、超薄切片機(AO型)、解剖鏡、震蕩器、恒溫箱、臨界點干燥器、JB一3型離子鍍膜機、單面刀片、銅網、解剖器材。
三、試劑 乙醚、2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸鈉緩沖液配制)、1％鋨酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、環氧樹脂(Epon812)包埋劑、醋酸鈾染液、檸檬酸鉛染液、雙蒸水、2％單寧酸、乙酸異戊脂、液態CO2。
【實驗內容】
一、透射電子顯微鏡的標本制備及觀察
(一)原理 電子顯微鏡是細胞生物學研究的重要工具，它以電子束為照明源，利用電子流具有波動的性質，在電磁場的作用下，電子改變前進軌跡，產生偏轉、聚焦，因而電子束透過標本后在電磁透鏡的作用下可放大成像。高速運動的電子流其波長遠比光波波長短，所以電鏡分辨率遠比光鏡高，可達0.14nm，放大倍率可達80萬倍。由熱陰極發射的電子在20～100千伏加速龜壓作用下，經聚光鏡聚焦成束，投射到很薄的標本上，并與標本中各種原子的核外電子發生碰撞，造成電子散射，在細胞質量和密度較大的部位，電子散射度強，成像較暗。在質量、密度較小處電子散射弱，成像較亮，結果在熒光屏上形成與細胞結構相應的黑白圖像。
(二)主要結構 電子顯微鏡由電子光學系統、真空系統和供電系統三大部分組成(圖17一l，圖17—2)。
1．電子光學系統是電鏡的主體，對成像和像的質量起著決定性作用。它是由電子槍、聚光鏡、樣品室、物鏡、中間鏡、投影鏡、觀察室和照像室等部分構成。
2．真空系統主要是使鏡筒內保持高度真空，一般要求達到10-4托（1托=lmmHg），是通過機械泵和油擴散泵接力排氣及真空墊圈的密封作用來實現的。真空度可由真空表指示。由于電鏡利用高速電子束為照明源，裁要求在電子束的通道上不能有游離氣體存在，以免與氣體分子 碰撞引起電離、放電、電子散射、燈絲氧化、樣品被污染等而影響觀察效果或發生故障。
3．供電系統主要是提供穩定的電源，包括高壓系統電源、各透鏡的電源及真空泵的電源等。
(三)透射電鏡生物標本超薄切片的制備(以家兔肝臟為例)。
1．取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打開腹腔，暴露肝臟，用鋒利的刀片切取lmm3肝組織，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常將動物麻醉取材。如動物處死后取材，要在幾分鐘內完成。取材最好在低溫條件下進行(0～4℃)，以防止動物死后細胞缺氧發生超微結構變化。

圖17—1 透射電鏡結構
2．固定 把肝組織立即投入到0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5％戊二醛中，4℃固定二小時(也可用0.1mol／L(pH7.4)的磷酸緩沖液 配制的2.5％戊二醛)。然后用0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液洗三次，再放入用相同緩沖液配制的1％鋨酸中固定2小時(4℃)。固定的作用是用化學試劑使細胞的微細結構如同生前狀態精確地保存下來。固定劑應能迅速進入細胞，穩定細胞結構，使其不變形，在脫水過程中不丟失細胞成分。