通過(guò)流式細(xì)胞儀研究斑馬魚(yú)胚胎中細(xì)胞周期分析

[精華提要]結(jié)合綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞周期分析廣泛的用于研究綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。這個(gè)方案是一種用綠色熒光蛋白標(biāo)記的斑馬魚(yú)胚胎來(lái)分析細(xì)胞周期的方法。
材料與試劑
1.        PBS（Invitrogen公司14040）
2.        胎牛血清
3.        乙醇
4.        PFA（USB）
5.        Hoechst 33342 溶液（請(qǐng)加目錄編號(hào)）
6.        40 uM細(xì)胞過(guò)濾器（BD 352340）
7.        聚苯乙烯管流式細(xì)胞儀（BD尖底細(xì)心管352054）
8.        50ml尖底細(xì)心管中（BD 352070）
設(shè)備：
1.        流式細(xì)胞儀
2.        離心機(jī)
3.        水浴鍋
步驟
1.        準(zhǔn)備流式細(xì)胞儀分析用的胚胎
1)      在37度水浴中解凍的胎牛血清。
2)      配制PBS + 5％FBS：9.5ml 0.9x PBS + 0.5ml FBS胎牛血清。
3)      把胚胎放置在一個(gè)5ml 的聚苯乙烯流式細(xì)胞管內(nèi)（每次分析50個(gè)胚胎）。盡可能多吸收液體，并添加1ml PBS / FB。
4)      用最大速度1 / 4的速度混勻胚胎。請(qǐng)檢查沒(méi)有胚胎/細(xì)胞團(tuán)塊。
5)      標(biāo)記每個(gè)胚胎的1X 50ml 管。將40μm的細(xì)胞過(guò)濾器放到1套50ml 管。
6)      吸取胚胎的勻漿到過(guò)濾器。用1ml PBS / FB沖洗管和沖洗到過(guò)濾吸管。
7)      轉(zhuǎn)移篩選后的胚胎到5ml 的聚丙烯流式細(xì)胞儀管。
8)      在2000RPM離心5分鐘。
9)      吸取上清液。
如果不固定，重懸于500μl 的PBS / FB，放在冰上。
2.        甲醛固定細(xì)胞和乙醇固定/通透細(xì)胞
1)      用500μL冷0.9x PBS輕微重懸細(xì)胞。
2)      加入500μL冷的2％PFA（0.9xPBS）。輕輕混勻。
3)      冰上孵育30分鐘。 （確保70％的乙醇冷凍。）
4)      4 °C離心2000RPM，5分鐘。
5)      吸取上清（單獨(dú)收集PFA到廢物容器）和1ml 的冷0.9xPBS洗一次。
6)      4 °C 、 2000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
7)      吸取上清。
Hoechst染色，直接按照Hoechst方案進(jìn)行。
8)      慢慢加入1ml 70％乙醇，-20℃下細(xì)胞沉淀下降到管的底部。
9)      冰上孵育30分鐘。
10)  在孵化過(guò)程中，準(zhǔn)備PI溶液（鋁箔！）
11)  4 °C離心2000轉(zhuǎn)，5分鐘。
12)  用500μLPI溶液重懸。
對(duì)于是固定的，沒(méi)有PI，在500μL 0.9xPBS重懸浮細(xì)胞
13)  在室溫暗箱中孵育30分鐘。
14)  過(guò)濾40μm至50ml 細(xì)胞管內(nèi)。
15)  細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5ml 的聚苯乙烯流式細(xì)胞儀管。
16)  置于冰上，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
3.        Hoechst染色
1)      準(zhǔn)備Hoechst 33342溶液，的1mg/ml儲(chǔ)存液 用0.9xPBS稀釋到1：1000。
2)      在28 ° C黑暗中孵育30分鐘。
3)      過(guò)濾40μm到50ml 管的細(xì)胞。
4)      將5ml 的聚苯乙烯流式細(xì)胞儀管的細(xì)胞。
5)      置于冰上，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
配方
1.  PI溶液（鋁箔）：
PI + RNaseA在0.9xPBS
500ul 1mg/ml的PI儲(chǔ)存液（20x）
100ul 10mg/ml的核糖核酸酶A股（1ul/ml）
9.4mL 0.9x的PBS