金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝的抑制
肉制品和乳制品等食品因富含蛋白質、多糖和脂質等營養物質而易受到食源性致病菌與腐敗菌的生物污染，特別是大腸桿菌。本課題組前期研究發現，金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，具有較好的胃腸耐受性和熱穩定性，對大腸桿菌具有較好抑菌活性，對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.4 mg/L，對EMP和TCA關鍵酶有不同程度的抑制作用，可造成細胞質膜氧化損傷和誘導氧化應激產生過量活性氧自由基，破壞細胞質膜結構與功能，但SIF4對大腸桿菌菌體呼吸代謝及能量代謝抑制機理尚未可知。
鑒于EMP和TCA代謝的普遍性及其對大腸桿菌能量生成的重要性，湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院著重從EMP和TCA視角分析金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝和能量代謝的影響，以期為SIF4在食源性大腸桿菌的生物防控提供理論支持。
1 對菌體新陳代謝活力的影響
取4 份菌懸液，分別加入SIF4使其終質量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC（MIC為0.4 mg/L，通過前期研究確定），以不添加SIF4組為陰性對照。SIF4對大腸桿菌細胞代謝活力影響如圖1所示。對照組（0 MIC組）菌體新陳代謝活力維持在正常水平，并未出現明顯波動，表明菌體能量代謝生產與釋放正常，細胞新陳代謝活力正常（＞97%）；經1/2 MIC、MIC和2 MIC的SIF4處理后，菌體新陳代謝活力顯著下降（P＜0.05），具有新陳代謝活力細菌占比分別下降至（63.09±2.02）%、（47.45±2.11）%和（28.80±2.03）%，相比對照組，菌體新陳代謝活力分別下降了35.17%、51.23%和70.41%，表明SIF4對大腸桿菌菌體新陳代謝有一定抑制作用。前期研究表明，SIF4可能以“毯式”模型破壞大腸桿菌菌體細胞質膜結構，增強細胞質膜通透性，并引起細胞膜去極化，同時，SIF4還可導致細胞質膜氧化損傷并誘導氧化應激產生過量自由基，從而破壞細胞質膜結構與功能。大腸桿菌新陳代謝過程中，為其傳遞能量的電子傳遞鏈主要位于細胞質膜內表面，當菌體細胞質膜受到SIF4刺激與破壞之后，可能喪失為新陳代謝傳遞能量的功能，因此，菌體代謝活力顯著降低。
2 對菌體呼吸代謝途徑抑制的影響
EMP是大腸桿菌最重要的能量與物質代謝途徑，HMP與EMP共同構成細胞糖分解代謝與有關合成代謝的調控網絡。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉分別是EMP、TCA和HMP途徑的典型標準抑制劑，可抑制相應代謝途徑從而降低呼吸代謝速率。
1/2 MIC、MIC和2 MIC組SIF4菌體呼吸抑制率分別為（6.692±0.451）%、（19.387±0.168）%和（25.222±0.326）%，呼吸抑制率與處理劑量呈正相關關系，且組間差異顯著（P＜0.05）。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉組菌體呼吸抑制率分別為（20.719±0.326）%、（24.047±0.165）%和（23.446±0.157）%，組間有顯著性差異（P＜0.05）。如上文所述，當SIF4與典型呼吸抑制劑抑制的主要呼吸代謝途徑相差越大時，由于增效作用，疊加率會越高，反之亦然，因此，若SIF4與典型抑制劑無協同增效作用，則疊加率較小，可由此判定SIF4的呼吸代謝抑制機理。
碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉與SIF4復配的呼吸疊加率分別為（1 9.982±0.133）%、（27.207±0.178）%和（33.304±0.566）%，碘乙酸和SIF4復配的呼吸疊加率最低，表明SIF4很可能通過抑制EMP影響菌體能量與物質代謝。前期研究發現，SIF4主要通過抑制大腸桿菌EMP的已糖激酶活性來表現高抗菌活性，本研究結果與前期研究所發現糖代謝抑制機理基本一致。
3 對菌體細胞質膜離子通道ATP酶的影響
Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶是極其重要的細胞質膜離子通道ATP酶，對維持細胞質膜通透性、結構完整性、低鈉高鉀胞內環境、靜息電位以及信號傳導有重要意義，Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性受膜流動性影響并受ATP水平調控。
SIF4對細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活性的影響，經SIF4處理后，菌體細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），1/2 MIC組、MIC和2 MIC組處理8 h時Na＋K＋-ATP酶活力比處理4 h時均有所上升，分別從（30.47±0.92）、（23.69±0.86）、（21.67±0.95）U/mg上升至（31.80±0.91）、（26.03±0.72）、（23.99±0.44）U/mg，特別是MIC組和2 MIC組，組內差異均顯著（P＜0.05）；8 h后Na＋K＋-ATP酶活力均顯著下降，可能是由于SIF4處理前期菌體為應激適應階段，通過增加細胞質膜離子通道ATP酶活力來增強菌體呼吸代謝和抵御外界不利環境；金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，帶正電荷，可與革蘭氏陰性菌細胞膜上脂多糖（LPS）通過靜電吸附作用結合于細胞膜脂質膜中，從而牽引整個抗菌肽分子進入質膜，擾亂質膜上蛋白質與脂質的有序排列，通過“位移”而聚合形成跨膜通道，從而破壞細胞膜結構完整性并導致胞內容物外溢，進而起到抑菌作用，推斷細胞質膜是SIF4重要的抑菌效應靶點。TritonX-100組隨處理時間延長，細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力顯著下降，處理12 h時，Na＋K＋-ATP酶活力由初始的（39.03±1.00）U/mg顯著降低至（2.41±0.67）U/mg（P＜0.05），降幅為93.83%，主要是由于TritonX-100為具有親水和疏水基團的非離子型去垢劑，可將膜蛋白從細胞質膜解離，破壞細胞質膜結構并增強膜通透性。細胞質膜受損會影響能量代謝和膜內外質子濃度差，并影響Na＋K＋-ATP酶活性，使基于細胞膜的轉運代謝無法完成并誘導細胞提前程序性凋亡。
SIF4對細胞質膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力影響，對照組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力穩定，無明顯波動（P＞0.05）。SIF4處理8 h后，與處理4 h相比，1/2 MIC和MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力略有上升，2 MIC組則呈下降趨勢。SIF4處理12 h時，1/2 MIC、MIC和2 MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力由初始的（27.55±0.88）U/mg分別降至（20.27±0.58）、（14.30±0.74）U/mg和（7.65±0.53）U/mg（P＜0.05），降幅分別為26.42%、48.09%和72.23%，可能是由于SIF4破壞了細胞質膜結構，改變了細胞質膜通透性，使胞內Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等離子泄露，破壞了膜內外離子電動勢，從而使細胞質膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著下降；此外，1/2 MIC和MIC組出現短暫Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力升高現象，隨后Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低，可能與菌體應激適應有關。有研究表明，胞內Ca2＋過量可損害能量系統結構和功能，誘導產生過量自由基并導致組織與細胞損傷，因此，Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性與細胞質膜結構完整及細胞質膜氧化損傷有一定關系。本研究還發現，TritonX-100組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力組內差異顯著（P＜0.05），這與其具有很強的細胞質膜結構破壞作用和影響細胞質膜通透性能力有關。
4 對菌體胞內ATP生物合成的影響
當細胞質膜受損或細胞凋亡時，胞內ATP含量迅速下降，ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態。初始階段組間胞內ATP含量無顯著差異（P＞0.05）。處理4 h時，實驗組與對照組均存在顯著差異（P＜0.05），但1/2 MIC與MIC組、MIC與2 MIC組組間無顯著性差異（P＞0.05），而1/2 MIC與2 MIC組存在顯著性差異（P＜0.05），可能與1/2 MIC組處理劑量較低和處理時間過短有關；處理8 h和12 h時，組間均存在顯著差異（P＜0.05）。本研究還發現，對照組培養0～12 h時，胞內ATP酶含量由初始（46.13±0.70）×10-6 μmol/g上升至（67.82±0.70）×10-6 μmol/g，增幅為47.02%，可能與菌體代謝旺盛，需要大量ATP為菌體物質代謝提供能量來源和碳骨架等中間體，以及菌體處于對數生長期等因素有關。TritonX-100組胞內ATP酶含量呈明顯降低的趨勢，從初始的（46.13±0.70）×10-6 μmol/g下降至處理12 h時的（6.09±0.72）×10-6 μmol/g，降幅達到86.80%，這與TritonX-100有較強的細胞質膜裂解能力有關；SIF4處理后，除呼吸代謝受到抑制外，胞內ATP含量也呈下降趨勢，特別是2 MIC組對胞內ATP合成抑制最為明顯，胞內ATP含量減少可能與ATP合成速率降低或胞內ATP水解加速有關，或與細胞質膜高度受損導致細胞質膜錨定的能量代謝酶功能受損、細胞質膜滲透性增加以及生物氧化與電子傳遞鏈不可逆受損等有關，本研究結果與Santos和Chingaté等報道結果相似。
5 結論
本實驗研究了SIF4對菌體新陳代謝活力、呼吸代謝途徑、細胞質膜離子通道ATP酶及胞內ATP生物合成的影響。結果表明，金屬抗菌肽SIF4處理可顯著降低菌體新陳代謝活力（P＜0.05），經2 MIC SIF4處理后，新陳代謝活力降低了70.41%；SIF4對菌體有較好的呼吸抑制作用，MIC和2 MIC組呼吸抑制率分別高達（19.39±0.17）%和（25.22±0.32）%；呼吸疊加率分析結果表明，SIF4可能通過抑制EMP影響菌體呼吸代謝；此外，SIF4處理后，大腸桿菌細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），推斷細胞質膜是SIF4重要的抑菌效應靶點；處理8 h和12 h時，實驗組組間胞內ATP含量均存在顯著差異（P＜0.05），胞內ATP含量降幅最明顯，特別是2 MIC組，可能與細胞質膜受損、ATP合成減少或消耗增加、細胞質膜通透性增加等因素有關。
