透射電子顯微鏡的原理與演示

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解剖、觀察和分析歷來是生物學研究的基本手段。用于細胞解剖觀察的主要工具就是顯微鏡，它是我們觀察細胞形態最常用的工具。但其分辨率的最小數值不會小于0.2mm(紫外光顯微鏡的分辨率也只能達到0.1mm), 這一數值是光學顯微鏡分辨率的極限。限制顯微鏡分辨率的關鍵因素是光的波長(光的衍射效應)，顯微鏡無論制作得如何精密都無法突破這一極限, 一般顯微鏡設計的最大放大倍數為1000~1500倍, 因為將0.2mm的質點放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨認清楚。如果分辨率不再提高, 只提高放大倍數毫無意義，并不能增加圖像的清晰度。

在光學顯微鏡下小于0.2mm的一些細微結構，即便是再提高放大倍數也無法看清，這些結構稱為亞顯微結構(submicroscopic structure)或超微結構(ultramicroscopic structure; ultrastructure)要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。于是，德國柏林大學的E. Ruska等便選擇了電子束為光源來突破光學顯微鏡分辨率的極限，終于在1938年研制出了世界上第一臺實用透射電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM)。目前所使用的顯微鏡, 根據光源不同，可分為光學顯微鏡(簡稱光鏡)和電子顯微鏡(簡稱電鏡)兩大類。前者以可見光(紫外光顯微鏡以紫外光)為光源, 后者則以電子束為光源。電鏡的問世，為細胞生物學的研究打開了局面。尤其是1953年瑞典學者成功制造出的超薄切片機以及隨后相繼出現的各種電子染色技術，使超薄切片技術得到快速發展和完善，從而大大推動了電鏡在生物學研究領域中的廣泛使用。

目前，電鏡技術在細胞生物學研究領域中已由細胞水平發展到了分子 和原子水平。英國學者A. Klug博士已將高分辨電鏡技術應用到了生物大分子的結構測定上，在核酸-蛋白質復合體的晶體結構研究中做出了突出成就，在1982年他也因此獲得了諾貝爾化學獎。現在，電鏡已經成為細胞生物學、分子生物學和分子遺傳學等不可缺少的重要研究手段之一，仍然將為細胞生物學等生物學領域的研究做出應有的貢獻。

實 驗 目 的

1. 通過對透射電鏡的結構和成像原理的講解, 了解透射電鏡的工作原理和結構。

2. 通過對電鏡演示，了解電鏡的操作方法及其在細胞生物學領域中的應用情況。

實 驗 用 品

透射與掃描電鏡、超薄切片機、幻燈機、投影儀、超薄切片示教片，以及各種細胞超微結構照片等。

實 驗 原 理

一、電鏡與光鏡的對比

1. 電鏡出現的必然性

普通光鏡雖然仍是我們觀察細胞形態最常用的工具，但由于其所用光源為可見光(或紫外光)，故其分辨率(Resolution)存在有一個無法突破的限制。分辨率是指顯微鏡能將近鄰的兩個質點分辨清楚的能力, 通常是用相鄰兩點間的距離(D)來表示B其公式如下：

分辨率的數值越小，顯微鏡的分辨能力就越大，反之越小。由上述公式可以看出，分辨率的數值與波長成正比，與鏡口率成反比。因此, 要想得到高分辨率必須要縮短波長和加大鏡口率，在普通光鏡中我們使用的光源為可見光，波長為400~700nm (平均值為550nm), 這個數值無法改變, 唯一可改變的數值為鏡口率(N.A.), N.A.的大小決定于鏡口角的大小和物鏡與標本間介質折射率(refraction coefficient)的大小。

由此可見，鏡口率與n及sin a/2成正比。制作鏡頭所用的光學玻璃的折射率為1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃越理想。空氣的折射率為1，水為1.33，香柏油為1.515，a-溴萘為1.66。鏡口角總是小于180°, 所以sin a/2的最大值必然小于1。對于干燥物鏡來說，介質為空氣, 鏡口率一般為0.05~0.95; 而油鏡用香柏油為介質, 鏡口率可接近1.5, 如果用溴萘則可達1.66。而就目前看來, 光鏡鏡口率的最大值也只有1.78。根據計算，光鏡分辨率的最小數值不會小于0.2mm(將1.6代入分辨率公式求得), 約等于光波的一半，紫外光顯微鏡的分辨率也只能達到0.1mm, 這一數值是光學分辨率的極限。限制光鏡分辨率的關鍵因素是光的波長(光的衍射效應), 光鏡無論制作得如何精密都無法突破這一極限, 所以一般光鏡設計的最大放大倍數為1,000~1,500′, 因為將0.2mm的質點放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨認清楚。

但在一般想象中, 似乎顯微鏡的放大倍數越大, 觀察到的物體應該越清楚。然而事實并不然，因為在這里涉及到有效放大和無效放大兩個概念。有效放大是指本來用肉眼看不清楚的物體經顯微鏡放大成像后可以分辨清楚的放大; 而無效放大則是指本來用肉眼能看清楚的物體經放大鏡、幻燈機或投影儀等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。此外, 我們所看到的物象是否清楚不僅決定于放大倍數，而且還要受到一些物理因素和透鏡質量的影響(例如球差和色差等), 但歸根到底, 影響顯微鏡成像清晰度最關鍵的因素是顯微鏡的分辨率。如果分辨率不再提高，只提高放大倍數毫無意義, 并不能增加圖像的清晰度。

在光鏡下即便是再提高放大倍數也無法看清亞顯微結構(或超微結構)。要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多(表1), 電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。于是，德國柏林大學的E.Ruska等便選擇了電子束為光源來突破光學顯微鏡分辨率的極限，終于在1938年發明了世界上第一臺實用透射電鏡。由此可見，電鏡的問世是研究細胞超微結構的必然需要。

2. 電鏡與光鏡的異同點

電鏡在結構上與光鏡相同，均是由照明光源和透鏡構成。所不同的是，

(1)電鏡所用照明光源為電子槍發射的高壓電子束，而光鏡為鹵燈(或汞燈)產生的可見光(或紫外光)。

(2)電鏡所用透鏡為電透鏡，聚焦方式為電聚焦; 而光鏡所用透鏡為光學透鏡, 聚焦方式為機械聚焦。

(3)電鏡所用介質必須是真空，而光鏡則為空氣(詳細區別見表2)。

電鏡與光鏡的成像原理也基本相同，但由于二者所用照明光源的不同，其成像機理又有著本質的區別。光鏡的成像過程是對可見光的反射與吸收; 而電鏡的成像過程則是通過對電子束的散射。

二、透射電鏡的結構與成像原理

1. 透射電鏡的結構

電鏡的基本構造見圖2。在結構上電鏡主要由真空系統、供電及保護系統、電子照明系統、成象系統和觀察記錄系統五大部分構成，其中, 電子照明系統、成象系統和觀察記錄系統又被稱為透鏡系統或電子光學系統。

(1) 真空系統 電鏡所用“光”源為高壓電子束，這就要求其介質必須處于真空狀態。一般說來，抽真空的意義有三: 

①防止燈絲的氧化損傷;

②確保電子束在運行過程中不受空氣分子的干擾(因為電子在運行過程中一旦遇到空氣分子便被散射或吸收, 會嚴重干擾電子的運動軌跡); 

③去除空氣分子對樣品的污染。

真空系統由機械泵、油擴散泵、真空管道、閥門、冷阱和儲氣罐等裝置構成。機械泵可從大氣狀態(1 Pa)抽到1.3′10-5~10-6Pa; 油擴散泵可從1.3′10-6Pa抽到1.3′10-7 ~10-9Pa;冷阱中加入液氮后還可以從1.3′10-9Pa抽到1.3′10-10Pa。對于一般的電鏡，真空度達到1.3′10-9Pa便可安全使用。但對于高分辨率的超高壓電鏡，真空度必需達到1.3′10-12Pa才能安全使用，這就要求除上述抽真空裝置外, 還必須使用離子泵和真空渦流泵等來大大提高真空度。

(2) 供電及保護系統 一般的電鏡均擁有兩個電源, 一個是高電壓低電流的高壓電源，主要作用是產生高速電子;另一個是低電壓高電流的透鏡電源，主要作用是控制高速電子束的運動軌跡。另外, 為了保證電壓和電流的高度穩定, 電鏡還配備有高精度的穩壓和穩流等保護與控制系統; 而且一旦電鏡的某一部分發生故障后, 電鏡的保護系統會讓其自動緊急關機和斷電, 以免損傷電鏡。

(3) 電子照明系統 由電子槍和兩級聚光鏡組成, 電子槍可產生高壓電子束，在燈絲前還有一柵板, 柵板中央有一孔經可調的小孔，用來控制電子束流的粗細, 以阻擋一些散射電子。極細的高壓電子束還要經過兩級聚光鏡進行會聚。第一聚光鏡將電子束的直徑縮小20~60倍，第二聚光鏡再將電子束的直徑擴大1~2倍，以期得到極細而均勻的電子束流。

(4) 成象系統 成象系統包括樣品室、成像和放大裝置。樣品室為放置樣品的部位，樣品放置在一金屬樣品托中(可同時放置兩個不同的樣品)，直接插入到樣品室中。此外，還有一冷阱直接與樣品室相連。冷阱由一液氮罐和一金屬導桿組成，金屬導桿直接插入到樣品室中。液氮罐中的液氮(-196℃)將低溫經金屬導桿直接傳遞到樣品室中, 低溫金屬導桿通過直接吸附樣品室中的少量空氣分子以提高真空度，而且樣品室內溫度的降低還可防止電子的熱漂移。

成像和放大部分分別由物鏡、中間鏡I、中間鏡II和投影鏡四級電磁透鏡組成, 透過樣品的電子經過物鏡后可被放大50倍，經中間鏡I可被放大3倍, 經中間鏡II可被放大15倍，經投影鏡可被放大200倍，共計可被放大約500,000倍。

(5) 觀察記錄系統 由觀察室、放大鏡和照相裝置構成。觀察室又包括熒光屏和鉛玻璃窗。透過樣品的電子打到熒光屏上可顯示出反映樣品真實結構的圖像。由于電子對人眼有害，故需要通過一個鉛玻璃窗來觀察，為了觀察得更加清晰，在觀察室外還配有一放大鏡。鑒于電子形成的熒光圖像衰減速度很快，所以一旦觀察到理想的結構圖像就需要盡快利用照相裝置進行照相。值得注意的是，電鏡照相與普通照相不同，圖像的反襯度最低時才是正聚焦，且底片還必須要經過預干燥處理。

2. 透鏡電鏡的成像原理

透射電鏡之所以能獲得高分辨率的圖像, 主要是因為它解決了兩個關鍵問題, 一是用電子槍發射出了波長極短的電子波, 二是利用電磁透鏡可控制電子的運動軌跡, 即可對電子束進行聚焦、放大和成像。故透射電鏡的有效放大倍數可高達數百萬倍。

電子槍發射出的高速電子束在磁場中聚焦，從而被會聚到待觀察的樣品上;電子束在通過樣品時會發生散射，但由于樣品不同部位的質量厚度不同, 即物質的組成結構不同，電子束發生散射的程度就不同;透過樣品后的電子束撞擊到熒光屏上，由電能轉變成光能，形成了濃淡不同的圖像。此圖像各處濃淡的不同真實反映了樣品不同部位的物質結構，因而可用來分析和研究樣品的超微結構。

由此可見，在透射電鏡中，被觀察粒子的大小一定要大于電子束的波長才能被分辨出來, 否則，電子束就會發生繞射，無法看到粒子。這也是電鏡的分辨率由電子束波長所決定的原因之所在。

另外，用于透射電鏡的標本須制成厚度僅有0.05mm的超薄切片，而且由于電子束不能透過玻璃, 因此這種切片需要用用特制的樣品托，而不能用普通光鏡所用的載玻片。

三、電鏡的分類

由于不同種類的電鏡在結構和使用方法上或多或少都有一定程度的交叉或重疊, 因此要試圖把所有各種各樣的電鏡進行完全合理的分類是十分困難的, 但就目前來講, 根據電子束和樣品之間作用方式的不同對電鏡進行分類是相對比較合理的一種方法, 總的看來，電子束和樣品之間的作用方式有如下四種: 1) 物體透射電子;2) 物體發射電子;3) 物體反射電子;4)物體吸收電子。常用的電鏡可分為透射電鏡和掃描電鏡兩大類。透射電鏡便屬于物體透射電子的一種類型，應用非常廣泛，既可以用來分析生物組織的內部結構，又可以用來研究金屬內部的晶體結構; 是當今世界上所用電鏡中數量最多的一類, 約占現有電鏡總數的90%左右, 掃描電鏡屬于物體發射電子這一類, 可以用來觀察復雜的表面圖像, 其焦深和分辨率不但比光鏡高出很多，而且還能顯示出樣品表面的立體形象。其它兩種作用方式的電鏡由于與我們細胞生物學研究關系不大, 在此就不再一一向大家介紹了。

四、電鏡的操作演示與示教

1. 電鏡操作的演示

學生參觀分兩組交叉進行，一組參觀透射電鏡，一組參觀掃描電鏡，然后再交換參觀內容。

2. 電鏡照片的展示

挑選一批具有代表性的動植物 細胞不同超微結構的電鏡照片，供同學們觀察和學習，以了解各種亞細胞結構的超微結構特征。

作 業

1. 通過本實驗的學習，比較光鏡與電鏡工作原理的區別。

2. 區分細胞的超微結構和顯微結構, 寫出各種示教細胞器的名稱及其結構特征。

思 考 題

1. 通過本實驗的學習，比較光鏡與電鏡的主要異同點。

答： 電子顯微鏡與光學顯微鏡的主要異同點

2. 總結掃描電鏡與透射電鏡的主要異同點。

答：常用的電鏡可分為透射電鏡和掃描電鏡兩大類。透射電鏡便屬于物體透射電子的一種類型，應用非常廣泛，既可以用來分析生物組織的內部結構，又可以用來研究金屬內部的晶體結構; 是當今世界上所用電鏡中數量最多的一類, 約占現有電鏡總數的90%左右, 掃描電鏡屬于物體發射電子這一類, 可以用來觀察復雜的表面圖像, 其焦深和分辨率不但比光鏡高出很多，而且還能顯示出樣品表面的立體形象。

[ 附 ] 掃描電鏡的結構與成像原理

在Oatley等學者的努力下，于1965年研制成功了世界上第一臺實用掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)商品。其功能是用來觀察標本的表面形態結構。它將標本表面上發射出的次級電子，由帶樣電荷的柵極收集后, 即向電子顯象管發送信號，在熒光屏上顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本表面的真實結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本要進行特殊處理。標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒, 重金屬在電子束的轟擊下會發出次級電子信號, 可用于電子成像。

1. 掃描電鏡的基本結構

掃描電鏡在結構上主要是由電子槍、電磁透鏡、掃描線圈、樣品室、信號的收集、處理及顯示系統，以及真空系統和供電保護系統等部分組成。其中, 電子槍、電磁透鏡、掃描線圈又被稱為電子光學系統。

其電子槍所發射電子的波長一般為1~10nm，使用的電壓范圍為1~10KV。掃描線圈為掃描電鏡所特有的結構，可作光柵狀掃描，以便在熒光屏上顯示出掃描圖像。掃描電鏡的樣品室較大，樣品有專用的樣品托，可在樣品室內進行各不同方向的平移和傾轉;另外，在樣品室內還裝配有檢測部件。信號的收集、處理及顯示系統包括次級電子探測器、光電倍增管和顯象管。次級電子探測器又由閃爍體和光導管構成，主要作用是收集由標本表面發射出的次級電子，并將其轉變成光子;光電倍增管可將光子信號放大后，又將其轉換成電壓信號;而顯象管便便可將所接受到的電壓信號轉變成為亮度不同的圖像。

2. 掃描電鏡的成像原理

電子槍發射出的電子束，經電磁透鏡會聚成極細的電子束，并進而聚焦在待測樣品表面;由于樣品各不同部位的表面形貌不同，入射電子束與樣品表面所噴涂的重金屬原子相互作用后所產生的次級電子信號也不同; 此次級電子信號為探測器接受后, 被轉變成光子，傳遞給光電倍增管進行放大和轉換;轉換成的電壓信號經掃描線圈掃描后顯示在顯象管的熒光屏上。

由于掃描線圈在樣品上作掃描光柵狀的逐點掃描，再加上顯象管的偏轉線圈電流與掃描線圈電流高度同步，因此，顯象管熒光屏上的任何一點的亮度與樣品表面上相應點所發出的次級電子數均是一一對應的，因此，顯示在熒光屏上的圖像就是樣品表面形貌的真實寫照。

綜上所述，掃描電鏡在結構和工作原理上均不同于透射電鏡。如(1)掃描電鏡所用樣品的制備方法簡便, 不需經過超薄切片，經固定、干燥和噴金后即可;(2)掃描電鏡采用的是次級電子成像; (3)掃描電鏡所觀察到圖像景深長, 圖像富有立體感, 但只能反映出樣品的表面形貌; (4)圖像的放大倍率在很大范圍內是連續可變的(101~105×);(5)樣品的輻射損傷及污染程度小等。但與透射電鏡相比，掃描電鏡又存在有其不可逾越的局限性，如(1)分辨率還不夠高; (2)無法顯示樣品內部的詳細結構等。為此，近年來出現了一種新的電鏡技術-冰凍蝕刻技術(freeze etching)，利用“復膜(replica)”在透射電鏡下進行觀察, 既可觀察到樣品的內部結構, 又可觀察到富有立體感的圖像, 還提高了分辨率。