穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：關(guān)于G 418各種信息與心得
在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 實驗中，G418的地位毋庸置疑。本文對G418的基本信息、使用方法、濃度選擇、實驗PROTOCOL、實驗心得做詳細介紹。
基本信息
G418是一種氨基糖苷類抗生素，這種氨基糖類抗生素的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細胞產(chǎn)生毒素 ，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞 ，也包括原生動物和蠕蟲。當neo基因被整合進真核細胞DNA后 ，則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA ，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達 ，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G418的這一選擇特性 ，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應用。
G418使用方法 室溫下運輸， 干粉在室溫下儲存，溶于水、甲醇，溶液于-20℃儲存 由于各真核細胞系對G418敏感度不同，各新細胞系或株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 時殺死非穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞所需用量需要通過實驗優(yōu)化。最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ug/ml等12個級別， 培養(yǎng)10-14天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半即可。
G418選擇濃度范圍
細胞系或機體 G418濃度(ug/ml)
中國倉鼠卵巢細胞 700～800
Madin-Darby犬腎細胞 500
人上皮A431細胞 400
猿CV-1細胞 500
盤基網(wǎng)柄菌屬 10～35
植物 10
酵母 125～500
G418質(zhì)量指標 G418 ：白色粉末，融點138～144℃，溶于水、甲醇。 CAS No.：108321-42-2
分子 式 ：C20H40N4O10 •2H2SO4 分子量 ：692.71
比旋：+104o～+121o 水分：≤10% 吸光值：≤0.015 (280nm，1mg/ml)， ≤0.1 (570nm， 100mg/ml)
效價： >700 ug/mg
[儲運] 室溫下運輸， 干粉在室溫下儲存，溶液于-20℃儲存。
G418篩選穩(wěn)定表達細胞系PROTOCOL 1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。
2.細胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時左右開始加藥。
3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。
4.加G418篩選: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。
5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。
6.確定最佳篩選濃度：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400ug/ml不能殺死細胞，而800ug/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進一步篩選，以確定最佳篩選濃度!心得：由于特性明確的細胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。
通過預實驗確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。
a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度增至50%～70%匯合時；
b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。
c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；
d 挑單克隆：制備細胞懸液，細胞計數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。
e 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測目的基因是否存在。
實驗方法總結(jié)
1，由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般 1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。
2，G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進行轉(zhuǎn)染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。
3，匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%
4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106個細胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。
加藥時間和維持濃度
1，由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。
最后小結(jié)：在進行轉(zhuǎn)染實驗之前，一定要對G418的具體情況作詳細了解，尤其是確定最佳篩選濃度，另外，篩選的時機也相當關(guān)鍵。
