藥物/毒物作用后的細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

四甲基偶氮唑鹽分析是將四甲基偶氮唑鹽還原成甲蠟的顏色，形成紫色，從而來(lái)測(cè)定活細(xì)胞中的酶活性，由于這些試劑能夠抑制細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)特性，該方法常用來(lái)測(cè)量毒性蛋白以及有毒物質(zhì)。

一、材料和試劑

1. MTT：四甲基偶氮噻唑藍(lán)（Sigma）

2. DPBS緩沖液（Invitrogen）

3. 一般的化學(xué)品（Sigma）

二、步驟

1. 96孔板中，每孔種植500~10 000個(gè)細(xì)胞，每孔體積200 ul。留8個(gè)孔不種植細(xì)胞，做空白對(duì)照。

2. 37℃，5%CO2條件下孵育過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁.

3. 每個(gè)孔中加2 ul 研究的藥物（溶解于DMSO中）。放置在漩渦振蕩器上，150 rpm 震蕩5分鐘，使得樣品完全混入培養(yǎng)液中。

4. 37℃，5%CO2條件下孵育1-5天，使得藥物/毒物發(fā)揮作用。

5. 每個(gè)96孔板準(zhǔn)備2 ml 或者更多的MTT溶液（溶于DPBS，濃度為5 mg/ml）。MTT在溶液中不能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，需要現(xiàn)配。

6. 每孔加入20 ul MTT溶液，放置在漩渦振蕩器上，150 rpm 震蕩5分鐘，使得MTT完全混入培養(yǎng)液中。

7. 37℃，5%CO2條件下孵育1~5小時(shí)，使得MTT完全被代謝。

8. 倒掉培養(yǎng)基（可以用濾紙吸干96孔板上的殘液）

9. 用200 ul DMSO重懸甲臜（MTT的代謝產(chǎn)物）。放置在漩渦振蕩器上，150 rpm 震蕩5分鐘，使得甲臜充分的溶解。

10. 560 nm 處讀取光密度值，減去670 nm 的背景光密度值。光密度值的高低與細(xì)胞的數(shù)量呈正關(guān)。