流式細胞術在高等植物研究中的應用

流式細胞術(Flow cytometry，簡稱FCM)是20世紀70年代發展起來的一種對細胞的物理性質及化學性質，如細胞大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等進行快速測定并可分類收集的技術。該技術超越了傳統顯微分析技術，能在瞬間對大量細胞進行準確的分析。這種快速有效的細胞分析技術已廣泛應用于細胞生物學、免疫學、發育生物學、細胞動力學、生理學、分子生物學等生物學研究的各個領域【--，在其基礎上建立的流式細胞儀系統，具有體積小、功能全和使用方便等特點。本文簡要介紹FCM 的原理，對其在高等植物研究中的應用作了綜述。

1流式細胞術的原理
流式細胞術是一種能夠對液流中的細胞或其他微粒進行多參數快速分析和分選的技術。它的工
作原理是：在一定壓力下，細胞隨鞘液從樣品池通過噴嘴中心進入照明室，通過激光束時使激光發生
散射和折射，由前向散射光(FSC，Forward scatter)和側向散射光(ssc，Side scatter)檢測器把散射光信
號轉換成電信號，同時細胞所攜帶的熒光素被激發后所發出的熒光由聚光器收集。不同顏色的熒光被
雙色反光鏡轉向不同的光電倍增管檢測器，經放大后的熒光信號和散射光信號一起通過數據化處理，
再輸入電腦儲存并據此對細胞進行分析和分選t21。
流式細胞術的主要特點是：
① 測量速度快，可在1 S內測定數萬個細胞；
② 同時進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理特性、化學特性的多參數測量，并具有明顯的統計學意義；
③ 是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等領域的知識和成果；
④ 既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。
總之，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的采集和分析技術等。

2.細胞的參量和熒光探針
FCM 是通過測量細胞的多種參量來獲取信息的，細胞參數分為結構參量和功能參量兩大類。結
構參量主要用于描述細胞的化學組分和形態特征，例如DNA、RNA的含量，總蛋白含量、胞內PH值
和細胞大小等；功能參量主要是描述細胞整體的理化和生物特性，如：細胞周期動力學、特殊配體的鑒
定、特殊細胞的生物活性等，這些參量有的需要經熒光標記才能被測定，有的并不需要熒光標記[4]。
2．1參數測量的原理
流式細胞計進行多參數測量時，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量
區進行，所謂測量區就是照射激光束與噴出噴孔的液流束的垂直相交點。當液流中央的單個細胞通過
測量區時，受到激光照射會向立體角為2"tr的整個空間散射光線， 散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對未經染色的活細胞進行分析和分選。經過固定和染色處理的細胞由于其光學性質的改變，散射光信號不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞參數相關，還跟散射角及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。
2．2細胞參數的測定
2．2．1 DNA和RNA含量
對DNA和RNA的測定及其含量的分析可以用多種熒光探針標記后測出。常用的熒光探針有吖啶橙(AO，Acridine―orange)、派洛寧Y(PY，I~yronineY)、HO(Hoechst)系列和色霉素A (CA )等。利用HO／CA 雙染色還可分析DNA的堿基組成，另外還可以結合BrdU(Bromodeoxyuridine，溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測定細胞內DNA的合成。
2．2．2蛋白質總量
用FCM 可以測定細胞中蛋白的總含量，以檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態，或區別具有不同蛋白含量的細胞亞群。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰酸熒光素(FITC，Huorescein isothio―cyanate)，FITC以共價鍵與蛋白上帶正電的殘基結合，經藍光激發后發出明亮的綠色熒光。
2．2．3特殊配體
配體是與不同的細胞結構特異性結合很強的各種大分子和小分子物質，通過對特異性熒光標記配體的測定可以獲得不少有關結構參量和功能參量的信息。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、羅丹明系列(如四甲基異硫氰酸羅丹明TRITC、異硫氰酸羅丹明X-RITC和美國德州紅等)、藻膽蛋白系列等。
2．2．4生物活性
生物活性的測定主要包括兩方面：① 細胞本身的死活；② 活細胞生物功能發揮的強弱。FCM用來判斷細胞死活的常用熒光探針有兩大類：一類是能透過活細胞膜進入細胞內而發出熒光的物質，例如二乙酸熒光素(FDA，Fluorescein diacetate)，它可被活細胞滯留而發出黃綠色熒光。若細胞有損傷則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜破損的細胞核進行染色，例如碘化丙啶(PI，Propidium iodide)和溴化乙錠(EB，Ethidium bromide)。
3流式細胞術在高等植物中的應用
3．1應用于植物中的特殊性
由于植物細胞與動物細胞在結構上的差異，例如植物細胞具有細胞壁、特殊細胞器以及中央液泡等，因此流式細胞術應用于植物細胞時，在樣品制備、染色、儀器的改造等方面都應適應植物細胞的上述特點。
3．1．1制備植物染色體懸液的材料
1984年De Laat和Blass用纖細單冠菊(Happus gracilis)的懸液細胞第一次對植物染色體懸液進行流式計數分析，然而核型的不穩定性卻成為流式細胞術應用于計數的最大障礙。隨后ConiatS]等嘗試著從幼葉原生質中分離出染色體進行分析，但由于細胞同步化程度較低，這種方法沒有得到廣泛的應用。直到1992年Dolezelt9]~lJ用根尖分裂組織制備細胞懸液，由于大多數植物的根尖較易獲得且其核型較穩定，因此利用根尖材料制備染色體懸液成為廣泛使用的方法。
3．1．2細胞周期同步化和中期染色體富集
為了富集足量同步化的中期染色體，秋水仙堿常被用于抑制有絲分裂過程中紡綞絲的形成。但由于其對植物微管蛋白親和力較低，需要使用較高的濃度，對人體會造成高毒性的危害以及在植物遺傳上產生不穩定性。另外秋水仙堿也會導致染色體過于粘稠，不適用于染色體分揀等后續操作。1992年Dolezel等發現應用甲基氨草磷(APM’Apiprophos―methy1)、安磺靈(Oryzalin)、氟樂靈(Trifluralin)等人工除草劑代替秋水仙堿，在微摩級濃度時便可見顯著的抗微管作用。
3．1．3染色體懸液的制備
由于植物細胞存在細胞壁，對染色體的分離造成了一定困難，通常有兩種方法從同步化的細胞中釋放染色體。其一，利用果膠酶和纖維素酶酶解細胞壁，然后將所獲得的原生質體置于低滲緩沖液中，使得染色體得以釋放；其二，將同步化根尖細胞經甲醛固定后進行機械分離從而釋放染色體。相對而言，后者更加快速，并且避免了長時間的酶解，減輕了對染色體的傷害。
3．1．4儀器的改造
由于植物細胞原生質體較大且脆弱，所以應使用100―200 Ixm孔徑的噴嘴，還應降低鞘液的壓力以保證通過噴孔的層流條件，并能夠觀察到液滴的形成，同時降低液滴形成的信號頻率，以使直徑大的液流能準確的形成液滴。此外還需降低液滴偏轉系統，以便觀察液滴。
3．2在植物學研究中的應用
3．2．1細胞核分析
FCM 在細胞核分析方面的應用范圍涉及DNA、RNA、蛋白質含量的分析、染色質結構分析、細胞周期分析、倍性分析等方面，是FCM在植物中應用最廣泛、最基本的領域。Van’t Hof[ 0]用Hoechst33258熒光素對棉花(Gossypium hirsutum cv．MD5 1ne)纖維細胞進行染色后，以人類口腔上皮細胞的細胞核DNA含量作為標準對照，通過FCM 分析， 發現花期過后2 d的胚珠內DNA含量增加了24％。由于在細胞周期的各時相中，染色質的凝集程度不同，經酸或堿處理后，變性程度也不同，Rayburn等通過調整與DNA結合方式不同的兩種染料的比例，經FCM 分析后確定玉米(Zea mays)中異染色質的含量。通過流式細胞術對細胞周期變化情況進行分析，李濤等【 2]認為交變應力作用可直接影響煙草細胞或細胞分裂的同步化，促進S期的DNA合成，有助于細胞的有絲分裂。另外，Wan 等應用流式細胞術分別對經花粉培養和花藥培養所獲得的椰菜(Brassica oleracea)再生植株進行DNA含量分析，認為經花藥培養所得到的植株更易發生染色體倍性變異。通過對野豌豆染色體倍性差異的分析，Kathleen等【 4】應用FCM 與根尖染色體壓片法，對美國農業部國家種子保藏實驗室的45個標記為長柔毛野豌豆(V&ia villosa)的標本進行鑒定，發現其中的兩個標本應為褐毛野豌豆 pannonica)，充分說明流式細胞術在植物種質資源鑒定中快速
而有效。由于FCM分析檢測速度快，工作周期短，獲得的信息量大，數據結果客觀準確，統計學精度
高，并且不使用放射性污染物質，現已成為細胞動力學研究和細胞周期分析的主要手段。
3．2．2原生質體分析
FCM 在原生質體分析方面的應用主要測定原生質體大小、細胞壁生物合成、原生質體與微生物的相互作用、原生質體融合產物分選、被膜抗原的表達等。在植物細胞研究中主要應用于分選出活的原生質體，并通過分選出來的原生質體再生出植株，其中最有意義的就是選出由原生質體融合所產
生的異核體。采用流式細胞術，對酸橙(Citrus aurantium L．)葉肉原生質體和甜橙(C sineniscv．Shamouti)胚性愈傷組織原生質體電融合后再生的體細胞雜種進行分析，結果表明，所有的體細胞雜種植株熒光強度是二倍體對照的兩倍，這說明兩者的原生質體已經融合。通過使用FCM 分析enod40轉染的擬南芥屬野生植物原生質體，Guzzo等發現導致前向角散射及細胞大小減少的基因有所表達，說明enod40對原生質體具有直接作用。用流式細胞術對熒光強度進行定量檢測，還可以用來定位植物激素結合位點的空間分布，Yamazaki等用生物素化脫落酸(bioABA)來定位蠶豆氣孔保衛細胞質膜的脫落酸感應位點，將位點用熒光素標記后，在保衛細胞原生質體表面可以觀測到熒光微粒斑點，通過成像系統成功定位脫落酸結合位點的空間分布情況。

3．3-3染色體分析
1975年，Gray等【 B]從中國倉鼠細胞中分離出染色體，用DNA熒光染料進行染色，根據染料含量的
不同用流式細胞儀將單個染色體進行分揀，開創了流式細胞遺傳學。由于在染色體懸液的準備與單條
染色體辨別方面存在著困難，利用流式細胞術分析與分選植物染色體一直未能取得預期的效果，但人
們發現使用轉座系和缺失系可以將一些無法分離的染色體從復合峰中分離出來【 。1984年，De Laat
和Blass~第一次報道了用流式細胞術識別和分揀植物染色體。隨后流式細胞術被證明是一個非常有
用的工具，它能快速精確地檢測染色體數目和結構的畸變，以及非整倍體和染色體缺失。目前已在l7
個物種中利用流式細胞術對染色體進行分析與分選，包括玉米(Zea may cv．Seneca 60)、小麥(Triticumaestivum L．)、大麥(Hordeum vulgare L．)、黑麥(Secalecereale)tar231等。另外，Macas等 在1993年利用FCM對碗~_(Viciafaba L． 流式核型進行分揀，結合PCR技術對其DNA進行物理定位， 成功實現了USP基因(unknown seed protein genes)、碗豆球蛋白基因(vicilin genes)和豆球蛋白毋基因(1egumin Bjgenes)、豆球蛋白 基因(1egumin B4 genes)、假基因(pseudogenes )在相應染色體區域上的定位。流式細胞術還可以分選出指定的染色體，用來建立染色體DNA 文庫，但目前在植物中僅有番茄
(Lycopersicon pennellii)t~和蠶豆( 口L．) 染色體DNA文庫的報道。李立家等已將流式細胞術和PCR技術相結合，應用于類玉米中抗病基因類似物序列的研究。

4展望
從1930年Caspersson和Whorellt31以細胞的計數開始，試圖尋找研究細胞的新工具，到1973年
BD公司與美國斯坦福大學合作，研制開發并生產了世界上第一臺商用流式細胞儀FACS I，流式細胞
術進入了一個空前飛速發展的時代。進入九十年代后，流式細胞術作為一門生物檢測技術已經日臻完
善，儀器的硬件平臺也已達到穩定的技術狀態。科學家和儀器制造商又紛紛將研究的焦點轉向熒光
染料的開發、單克隆抗體技術、細胞的制備方法以及提高電子信號的處理能力上來，以拓展日趨廣泛
的應用領域。

流式細胞術的強大生命力植根于生物學、醫學的各個領域，正是這些日新月異、變化多樣的應用項目在全球范圍內推動了流式細胞術的發展。目前，利用流式細胞術不但可以對植物細胞進行計數、測量基因組大小、還能分析細胞周期、進行流式核型(染色體的DNA含量)分析、分揀染色體以及構建染色體文庫等。由于FCM分選系統可提供純度較高的特異性細胞群，因此利用流式細胞術分檢純化出的染色體在分子生物學后續研究領域有著廣闊的應用前景，例如利用PCR技術進行物理圖譜的繪制、FISH與PRINS遺傳圖譜的繪制、植物基因組的分析、染色體蛋白的免疫定位[27-3o]等。

近年來，FCM作為一種日漸成熟的技術， 已經深入到植物研究的諸多領域，給工農業生產和科學研究提供了一個強有力的工具。但是，這種技術還有一些自身的缺點，如價格昂貴、對操作人員要求
高以及樣品需要復雜的前處理等，這都限制了流式細胞術在植物領域中的應用。然而，隨著新型多功
能流式細胞儀的研制、多參數分析技術的建立以及各種分析軟件的開發，我們相信流式細胞術作為一
種不斷完善的技術在植物學研究中將有更加廣闊的應用前景。