平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法
貼壁法原代培養(yǎng)
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
1.1.1 培養(yǎng)液配制 DMEM（美國(guó)Gibco公司），Hepes（15mmol/L），青霉素（100u/ml），鏈霉素（100mg/ml），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（原代培養(yǎng)濃度20%，傳代培養(yǎng)濃度10%，美國(guó)Hyclone）。
1.1.2 培養(yǎng)器皿 25cm2塑料培養(yǎng)瓶（Costar），培養(yǎng)面積25cm2；直徑3.5cm培養(yǎng)皿。
1.1.3 大鼠血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物來源：健康Wistar大鼠，由第三軍大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不拘，體重150~180g。動(dòng)脈取材：斷頸法處死Wis-tar大鼠，無菌條件下分離全段主動(dòng)脈，立即置于含青霉素100u/ml，鏈霉素100mg/ml的無菌生理鹽水中。每次取材2~3只大鼠。貼壁法原代培養(yǎng)：超凈工作臺(tái)上，清除結(jié)締組織，剝除動(dòng)脈外膜。縱向剖開血管，用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜面，以去除內(nèi)皮細(xì)胞，剩余血管中膜組織較薄、透明、韌性好。用含青、鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗，去除脂滴、血凝塊等雜質(zhì)及可能殘留的內(nèi)皮細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞，然后將一次取材的2~3條血管的中膜組織混合在一起，置于無菌培養(yǎng)皿中。滴加少許培養(yǎng)液使組織保持濕潤(rùn)，用眼科彎剪反復(fù)剪切成1mm×1mm大小的組織塊。并剪切好的組織小塊均勻擺置于瓶底，組織塊間距0.5cm。蓋好瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶?jī)?nèi)注入適量培養(yǎng)液，于37℃孵箱內(nèi)放置2~4h使組織塊干涸并與瓶壁貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)3~5d。待有細(xì)胞從組織塊周圍游出后換液。
1.1.4 原代培養(yǎng)動(dòng)脈VSMC的傳代培養(yǎng) 當(dāng)大部分組織塊長(zhǎng)出細(xì)胞暈，并與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞暈接觸時(shí)即可傳代。加入配制好的消化液使其恰好覆蓋細(xì)胞表面，室溫下大約1~2min，倒置顯微鏡下見細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫離消化液，吸棄消化液，加入含胎牛血清培養(yǎng)液3~4ml終止消化并反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞使細(xì)胞脫壁，分散為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液一分為二接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液（每瓶3~4ml）。未消失的組織塊會(huì)隨細(xì)胞換液、傳代而除去。
1.3 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定
1.3.1 形態(tài)學(xué) 用相差顯微鏡常規(guī)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及生長(zhǎng)規(guī)律，并依常規(guī)制作電鏡標(biāo)本進(jìn)行觀察。
1.3.2 免疫組織化學(xué)鑒定 特異性鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（福建邁新生物技術(shù)公司），采用SP法對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。（α-SM-actin免疫組織化學(xué)鑒定）
胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞
1.1 試劑和動(dòng)物
胰酶購(gòu)自Sigma公司；α-actin抗體購(gòu)自中山生物技術(shù)有限公司；PBS液各成分均為市售分析純；新生小牛血清購(gòu)自HyClone；DMEM為Gibco產(chǎn)品。雄性Wistar大鼠（2只，體重175±25 g）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2 胰酶消化法原代培養(yǎng)
Wistar大鼠處死，迅速取出胸主動(dòng)脈，浸泡在含無菌PBS的表面皿中，轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺(tái)。在表面皿中漂洗主動(dòng)脈去除殘留的血跡，縱向剪開主動(dòng)脈，把主動(dòng)脈鋪平并使內(nèi)膜朝上，用鑷子來回刮除內(nèi)膜層，剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養(yǎng)瓶中于37℃條件下消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察組織塊表面出現(xiàn)大量細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即加入血清終止消化，一般消化的時(shí)間在3.5 h。終止消化后將玻璃培養(yǎng)瓶置于37℃空氣搖床振搖10 min，繼續(xù)用吹打的方法使組織塊表面的細(xì)胞盡可能脫落。待細(xì)胞從組織塊脫離后，120目細(xì)胞篩過濾，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)離心，棄上清，用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，最后接種于25 mL培養(yǎng)瓶，放入CO2孵箱培養(yǎng)，48 h后換液。
1.3 傳代培養(yǎng)
細(xì)胞融合后，倒去舊的培養(yǎng)液，加入適量的0.25%胰酶，顯微鏡下觀察，見細(xì)胞收縮后去除消化液，加入適量培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，以1∶2接種于新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。傳代細(xì)胞從第三代開始可換用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。VSMC至少可以傳16代以上，并且從第二代開始平滑肌細(xì)胞即可凍存。
1.4 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定
相差顯微鏡下，細(xì)胞未匯合之前多數(shù)呈梭形，至匯合后，部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列，呈典型的“峰和谷”狀態(tài)。將傳代獲得的平滑肌細(xì)胞接種于蓋玻片上，3~4天后至亞匯合狀態(tài)，取出細(xì)胞爬片，PBS清洗后用4℃純丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌動(dòng)蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定VSMC肌動(dòng)蛋白。根據(jù)S-P免疫組織化學(xué)染色的常規(guī)方法，以平滑肌細(xì)胞胞漿棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。
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