第二十章 DNA重組與基因工程
DNA Recombination and Genetic engineering
基因工程(genetic engineering)和遺傳工程的英語中是同一個(gè)詞匯。從字面上看,遺傳工程就是按人們的意思去改造生物的遺傳特性、或創(chuàng)建具有新遺傳物性的生物。遺傳是由基因決定的，改建生物的遺傳性，就是改建生物的基因，因此狹義的遺傳工程就是基因工程。
對多數(shù)生物來說，基因本質(zhì)是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新組合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重組（DNa recombination）。
圖20－1 基本工程的基本程序
重組、建造的DNA分子只有純化繁殖才有意義。純的無性繁殖系統(tǒng)稱為克隆。純化繁殖DNA就稱為DNA克隆或分子克隆，基因的純化繁殖就稱為基因克隆。所以DNA重組和分子克隆是與基因工程密切不可分的，是基因工程技術(shù)的核心和主要組成部分。重組DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名詞。
只有當(dāng)人類對遺傳現(xiàn)象本質(zhì)和規(guī)律有深入的認(rèn)識(shí)，才能按人類的意志去改造或創(chuàng)建生物的遺傳特性。20世紀(jì)50-60年代分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，確定了主要遺傳物質(zhì)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)、闡明了遺傳信息傳遞的中心法則、破譯了遺傳密碼，為基因工程奠定了理論基礎(chǔ)；同時(shí)酶學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)的發(fā)展，為基因工程提供了必要的工具。1972-1973年Boyer、Cohn和Berg等創(chuàng)立了DNA克隆技術(shù)，打破了種屬的界限，第一次使本來只存在于真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)能夠在大腸桿菌中合成，這是基因工程誕生的里程碑。科學(xué)界公認(rèn)基因工程的出現(xiàn)是20世紀(jì)最重要的科學(xué)成就這一。標(biāo)志人類主動(dòng)改造生物界的能力進(jìn)入新的階段。分子生物學(xué)的成就是DNA重組技術(shù)和基因工程出現(xiàn)和發(fā)展的基礎(chǔ)，而DNA重組技術(shù)和基因工程的發(fā)展又有力地推動(dòng)著分子生物學(xué)的進(jìn)步。
基因工程屬于生物技術(shù)范疇，生物技術(shù)（biotechnology）不是一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科而是一套技術(shù)或手段。廣義的生物技術(shù)指任何利用活的生物體或其一部分生產(chǎn)產(chǎn)品或改良生物品質(zhì)的技術(shù)；狹義的生物技術(shù)是專指以DNA重組技術(shù)和單克隆技術(shù)為標(biāo)志發(fā)展起來的新技術(shù)。如無特別說明，通常生物技術(shù)一詞就專指新的生物技術(shù)而言。一般認(rèn)為這新的生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程幾方面的內(nèi)容。基因工程是生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)；細(xì)胞技術(shù)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)；酶工程是生物技術(shù)的條件；發(fā)酵工程是生物技術(shù)獲得最終產(chǎn)品的手段，四個(gè)方面相互聯(lián)系的。生物技術(shù)是一個(gè)綜合技術(shù)體系，其中基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)最為突出。蛋白質(zhì)工程（protein engineering）則是在基因工程基礎(chǔ)上綜合蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)輔助設(shè)計(jì)等知識(shí)和技術(shù)發(fā)展起來的研究新領(lǐng)域，開創(chuàng)了按人類意愿設(shè)計(jì)和研制人類需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期，被稱為第二代基因工程。
基因工程的基本程序見圖20-1所示。
第一節(jié) 工具酶
DNA重組技術(shù)中對核酸的“精雕細(xì)刻”主要用酶作為工具。分子生物學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn)的酶，許多都用作工具，表20-列出最常用的幾種工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）在重組DNA技術(shù)中有重要地位，在此較詳細(xì)介紹。
一、限制性核酸內(nèi)切酶的概念
核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識(shí)別外來的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識(shí)別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會(huì)被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來。
二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名
按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
三、限制性核酸內(nèi)切酶的分類
按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：
Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶 由3種不同亞基構(gòu)成，兼具有修飾酶活性和依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性，它能識(shí)別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，去隨機(jī)切斷在識(shí)別位點(diǎn)以外的DNA序列，通常在識(shí)別位點(diǎn)周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶 與Ⅰ類酶相似，是多亞蛋白質(zhì)，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點(diǎn)在識(shí)別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。
Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶 只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言。
表20-1 DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶
酶 主要用途 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別DNA特定序列，切斷DNA鏈 DNA聚合酶Ⅰ
或其大片段（Klenow） ①缺口平移制作標(biāo)記DNA探針
②合成cDNA的第二鏈
③填補(bǔ)雙鏈DNA3’凹端
④DNA序列分析 耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） DNA連接酶 連接兩個(gè)DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5’羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在3’末端加入同質(zhì)多聚物尾 SI核酸酶，綠豆核酸酶 降解單鏈DNA或RNA，使雙鏈DNA突出端變?yōu)槠蕉?DNA端酶Ⅰ 降解DNA，在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口 RNA酶A 降解除RNA 磷酸酶 切除核酸末端磷酸基
四、限制性核酸內(nèi)切酶的作用
大部分限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3’羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有三種不同的情況：
①產(chǎn)生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 為例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
②產(chǎn)生5’突出的粘性末端：以PstⅠ為例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③產(chǎn)生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ為例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’
不同有限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列可以不相同。有的識(shí)別四核苷酸序列，有的識(shí)別六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是隨機(jī)排列的，則一個(gè)識(shí)別四核苷酸序列的內(nèi)切酶平均每隔256bp出現(xiàn)一次該酶的識(shí)別切割位點(diǎn)，同樣的對識(shí)別六或八核苷酸序列的內(nèi)切酶則大致上分別是每隔4kb或65kb出現(xiàn)一次識(shí)別切割位點(diǎn)。按此可大致估計(jì)一個(gè)未知的DNA分子限制性內(nèi)切酶可能具有切點(diǎn)頻率，以便選用合適的內(nèi)切酶。
限制性核酸內(nèi)切酶的種類很多，至今已發(fā)現(xiàn)近800多種，可以根據(jù)它們對DNA有不同的識(shí)別序列和切割特征選用，從而為基因工程提供了有力的工具。表20-2列出了幾種最常用的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切割點(diǎn)。
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