DNA酶切及凝膠電泳
第一節(jié) 概 述
一. DNA 的限制性?xún)?nèi)切酶 酶切分析限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA 序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類(lèi):Ⅰ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴(lài)于ATP 的存在。Ⅰ類(lèi)酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類(lèi)酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類(lèi)由兩種酶組成: 一種為限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類(lèi)中的限制性?xún)?nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA 的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類(lèi)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4 至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱(chēng)特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類(lèi)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱(chēng)軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱(chēng)軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱(chēng)粘性未端, 如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3"3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性?xún)?nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性?xún)?nèi)切酶的活性。大部分限制性?xún)?nèi)切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性?xún)?nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性?xún)?nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性?xún)?nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性?xún)?nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性?xún)?nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1 倍體積3mol/L NaAc 和2 倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置-70℃ 低溫冰箱30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。DNA 限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜又稱(chēng)DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線(xiàn)或環(huán)狀圖式表示。在DNA 序列分析、基因組 的功能圖譜繪制、DNA 的無(wú)性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性?xún)?nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。構(gòu)建DNA 限制性?xún)?nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。
酶切圖譜的使用價(jià)值依賴(lài)于它的準(zhǔn)確性和精確程度。在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1μg。限制性?xún)?nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃ )。對(duì)質(zhì)粒 DNA 酶切反應(yīng)而言, 限制性?xún)?nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。
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