實時定量PCR應用中的問題
實時定量PCR已廣泛地運用于分子生物學的各個領域，就目前的應用情況來看，雖然取得了很好的效果，但是其在方法學上的選擇、敏感性問題、重復性問題等都一直是爭論不休的，本文將就這些問題做出探討。
1. 方法的選擇 ：研究者在實驗中往往想要得到目的基因的絕對量，因為絕對定量對目的基因的表達差異有直接的反映[38]。絕對定量最為簡單的方法就是標準曲線法，用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒dsDNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA[39]。目的基因與標準品在不同的反應管內同時進行擴增，使用的熒光材料可以是雜交探針、水解探針或是SYBR Green I。有研究表明[40]，這一方法的動力學范圍可以達到9個數量級，遠比終點法的要高。這一方法雖然簡便，但是為了得到可靠的實驗結果，有兩個先決條件必須等到滿足，一是所選用的標準品必須與目的基因的擴增效率一致，要達到這個要求，需要標準品同目的基因的同源性盡可能的高，不僅長度相似，而且其堿基組成也盡量相同；二是要盡可能地優化實驗條件和模板的準備過程。就標準品而言，實踐中有外參照和內參照之分，作為外參照的標準品與目的基因不在同一反應體系中進行擴增，所以它無法檢測也不可能補償可能出現在目的基因反應體系中的影響因素，如PCR抑制子[41]。事實上，在絕大多數的實驗中，要想使標準品和目的基因的擴增效率完全一致是不可能的。為了彌補單獨使用一個標準品作為外參照的不足，研究者便引入一個內參照同目的基因在同一反應體系中同時進行擴增，以反映體系中可能出現的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR。競爭性PCR 所使用的內參照具有與目的基因序列相同的引物結合位點，但不具有相同的探針結合位點[42]。關于內參照的設計，有多種方法可供選擇，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變[43]，改變目的基因中的某些核苷酸[44]，設計不同的限制性酶識別位點[45]，也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內參照[46]。競爭性PCR 設計的原理在于內參照與目的基因相互競爭反應的原料，所以兩者的量應當相互匹配，如果一方的拷貝數大大的高于另一方，那么拷貝數多的一方就會在反應體系中得到優先擴增，而拷貝數少的一方則擴增受到抑制，定量也就不能有效地進行。由于使用了內對照，所以一旦體系中存在干擾PCR擴增的因素，就會通過內對照的擴增效率的變化反映出來，目前使用的實時定量PCR儀都是以擴增曲線上crossing point的漂移來體現擴增效率的變化的。競爭性PCR 由于能夠消除反應體系中干擾因素的影響，所以它所等到的結果要準確可靠得多，但是由于在反應體系中同時擴增兩種模板，使得其結果的測定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個數量級[40]。正是由于競爭性PCR 有利有辟，所以研究者應根據不同的情況決定是否使用內參照。
在目前的研究中，大多數研究者選擇使用絕對定量的方法，但是也有學者[47]認為在當前的條件下，絕對定量具有難以克服的缺陷，主要包括:
(1)制作一系列稀釋濃度的標準品不僅費時費力，而且也有相當多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會影響到結果的穩定性。
（2）標準品的穩定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質易于被降解，而每次配制新的標準品又會增加批間差異。
（3）每次測定樣本都要同時測定標準品，而熱循環儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內測定更多的樣本，這樣也就使實時PCR 的高通量有所降低。
（4）由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標準品與目的基因的擴增效率一致。這樣會大大增加結果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會對定量的結果造成很大的差異。鑒于以上原因，這些學者強烈地推薦使用相對定量的方法，所謂相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因，該管家基因的作用有
（1）用于核苷酸的拷貝數的比較；
（2）作為內源性對照補償待測樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應體系內是否存在PCR擴增的影響因素；
（3）標準化標本[47]。由于管家基因在各種組織中是恒定表達的，所以可以以管家基因的定量來作為某種標準以比較樣本來源不同的目的基因表達量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根據具體的需要而選定合適的管家基因。使用的相對定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標準曲線，根據該標準曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最后結果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴增效率一致。除了這種常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]設計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達，他們根據數學推導得出目的基因的量=2-^^Ct，在該公式中，Ct是熱循環儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)實驗組-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)對照，所以，2-^^Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標準曲線，所以這一方法更為簡便省時。統計學結果表明這一方法的結果也是相當可靠的。
總之，相對定量不僅比絕對定量更加簡單，經濟（如果不做標準曲線），而且也更為可靠和準確，因為存在于反應體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過數學處理而去除。
2. 重復性問題 ：重復性是判斷實驗結果優劣的重要指標，其主要判斷指標為標準差（SD）和變異系數（CV）。對于特定的分析系統，重復性的高低決定了PCR反應能檢測出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于PCR反應本身具有不精確擴增的特性，它所造成的結果精確性要遠小于經典的臨床化學檢驗和免疫分析。對于絕大多數實驗，一般都可以計算出所設計體系能檢測出樣本初始濃度的最小值，根據多次實驗可以求得該最小值的變異情況和它的可信區間范圍，變異越小或是可信區間范圍越小，說明這一反應體系的精確度越高。在實時定量PCR過程中，從樣本的準備到擴增，再到定量的進行，實驗中的每個方面都與實驗的重復性息息相關，除了加樣的準確性和實驗所選用的儀器固定參數的限制之外，影響結果重復性較為關鍵的因素還包括
（1）PCR 反應擴增的效率，如果在反應體系中擴增效率不一致，就會影響到目的基因在單位時間內的產量發生差異，從而影響到結果的穩定，要解決這個問題，必須盡量優化實驗條件，使反應體系達到最佳擴增效率。
（2）目的基因的初始濃度，初始拷貝數越低，結果的重復性越差，為了保證獲得精確的結果，應使用初始濃度具有較高數量級的樣本，如果待測樣本中目的基因的量處于反應體系的檢出限附近，那么最好是使用復孔以保證結果的可靠性。
（3）標準曲線的影響，對于必須進行絕對定量的研究，標準曲線是必不可少的，雖然標準品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個好的標準曲線對定量結果至關重要，在制作標準曲線時，應至少選擇5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現的全部濃度范圍，理想的標準品應與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質粒DNA 或是體外合成、轉錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應使用規范的步驟或是根據所購買的試劑盒提供的標準操作手冊進行。
3. 敏感度問題：實時定量PCR 由于使用了熒光物質作為定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]報導實時定量PCR 的敏感性要高出傳統的終點定量PCR 大約250倍。在理論上，只要設計的引物對目的基因有足夠的特異性，PCR 應可檢測出只含一個拷貝目的基因的樣本，也的確有人報導在特定的反應條件下，實時定量PCR 可以檢測出單細胞水平的基因組DNA[11]，但是在大多數情況下，對基因組DNA而言，它的最低檢出限一般在pg到fg級，對于病毒、質粒而言，其檢出限一般在102-103拷貝數以上[8]。影響實時定量PCR 敏感性的因素眾多，除了對一般PCR反應均存在的影響因素如反應體系、Taq酶的活性之外,實時定量PCR還有其特殊的影響因素，包括：
(1)反應體系中形成的引物二聚體的影響：引物二聚體是非特異性退火和延伸的產物,它的形成不僅會影響到擴增的效率,而且由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結合,所以會在反應體系中出現特異性產物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現象,從而降低了實時PCR的敏感性。要解決這個問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的形成，但是在定量檢測時，它卻可以避開引物二聚體的干擾，專一地測定來自于特異產物的熒光信號，有文獻報導使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用熱啟動辦法，所謂熱啟動是指在反應體系達到引物退火溫度時才加入某一反應成分，因為引物二聚體的是在各種試劑一經混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少引物二聚體的形成，另外Lightcycler提供一種Taq酶的抗體，在PCR反應的最初階段，這種抗體能阻斷Taq酶的作用，但是當反應溫度達到70度時，它便失活，使Taq酶開始發揮作用，在反應體系中加入這一抗體的目的也就是使要在反應達到較高溫度時，才開始PCR擴增，從而避免反應初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優化引物設計，例如所設計的兩條引物不能互補（尤其在3’端），使兩條引物的GC含量大致一致，使用純化的引物進行實驗等，這些都是防止引物二聚體形成的根本因素。第四，如果反應體系中出現PCR的抑制因素，應適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。最后，在實驗過程中應當注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經混合后立即開始進行擴增。
（2）循環數：一般的實時定量PCR反應只須25－30個循環便可獲得滿意的結果，但是對于那些極微量的待測樣本而言，適當增加循環數可以提高反應的檢出限，有文獻報導當循環數從25增加到34個循環時，實時定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環數增加得越多，其敏感性就會越高，實際上，當循環數增加到某一值時，敏感性便不再升高，因為循環數并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實驗過程中，也不可能因為增加敏感性而無限制地增加循環數，這不僅是實踐中行不通，而且在理論上也不可行，因為隨著循環數的增加，一方面，聚積的產物會抑制Taq酶的活性，另一方面，也會增加形成異源二聚體的可能性，這些都會影響到最終的定量結果。
（3）Mg2＋的濃度：根據Roche公司的Lightcycler3.5版本技術說明，Mg2 的濃度將影響到實時定量PCR的敏感性，其推薦使用的濃度為3mM。Mg2 濃度對敏感性的影響主要存在于兩方面，首先，Mg2 是影響Taq酶活性的關鍵因素，如果Mg2 的濃度無法達到使Taq酶發揮最佳活性，無疑將會影響到實時定量的敏感性；其次，Mg2 的濃度過高，會增加引物二聚體的形成，從而導致敏感性降低。所以在反應中選擇合適的Mg2 濃度條件，是相當重要的。
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