組織與細胞蛋白樣品的制備

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 組織和細胞的來源：
1.1.2 儀器 設備
機械組織勻漿器
低溫高速離心機 (>40,000 g)
超速離心機
超生細胞破碎儀
超純水裝置
1.1.3 試劑
三氯醋酸 (TCA)
丙酮
二硫蘇糖醇 (DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考馬斯亮藍R350
抑肽素A
亮肽素
試劑 純度均應是分析純或以上。
1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na ₂ HPO ₄ 1.44 g, KH ₂ PO ₄ ，溶于800 ml水中，用HCl調pH至7.4，用純水定容至1 L；
(2) EDTA 儲存液：
18.61 g Na ₂ EDTA·2H ₂ O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調節pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml。可高壓滅菌后分裝備用；
(3) 亮肽素儲存液 (50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用時配成50 μg/ml儲液，-20℃保存；
(4) 抑肽素儲存液 (70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用時配成70 μg/ml儲液，-20℃保存；
(5) PMSF儲存液 (10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，-20℃ 保存。
(6) DTT 儲存液 (1 M):
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理，可過濾除菌)。
(7) 裂解液:
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
●CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。
(8) 蛋白酶抑制劑混合物[3]

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