凝膠層析技術
凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。具有分子篩作用的物質很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應用最廣，商品名是sephadex型號很多，從G10 到G200 ，它的主要應用范圍是：
①分級分離各種抗原與抗體；
②去掉復合物中的小分子物質。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質碎片；
③分析血清中的免疫復合物；
④分子量的測定。
（一）原理
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。
（二）葡聚糖凝膠的種類與性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環氧丙烷交聯劑交聯而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性，交聯度大，吸水性小，相反交聯度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯度越大，吸水性越小，G值越大，交聯度越小，吸水性就越大，二者呈反比關系，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。
表 Sephadex1的種類與特性
型號 | 分離范圍 （分子量） | 吸水量 （ml/g） | 最小溶脹時（h） 20℃～25℃ 100℃ | 床體積（ml）/干凝膠（mg） |
G10 | ＜700 | 1.0±0.1 | 3 1 | 2~3 |
G15 | ＜1 500 | 1.5±0.2 | 3 1 | 2.5~3.5 |
G25 | ＜5 000 | 2.5±0.2 | 3 1 | 4~6 |
G50 | 1500～20 000 | 8.0±0.3 | 3 1 | 9~11 |
G75 | 3 000～70 000 | 7.5±0.5 | 24 1 | 12~15 |
G100 | 4 000～15 000 | 10.0±1.0 | 72 1 | 15~20 |
G150 | 5 000～800 000 | 15.0±1.5 | 72 1 | 20~30 |
G200 | 5 000～30 0000 | 20.0±2.0 | 72 1 | 30~40 |
G25 、G50 有四種顆粒型號：粗（100μ~300μ）、中（50μ~150μ）、細（20μ~80μ）和超細（10μ~40μ）。G75 ～ G200 又有兩種顆粒型號：中（40μ～120μ），超細（10μ～40μ）。顆粒越細，流速越慢，分離效果越好。
表 DEAE－纖維素與Sephadex1比較
項 目 | DEAE纖維素 | Sephadex |
交換量 | 小 | 較大 |
非特異性吸附 | 較大 | 小 |
分離純度 | 較好 | 好 |
分離時間 | 較粗 | 較長 |
應用范圍 | 較窄 | 較寬 |
預處理 | 繁瑣 | 方便 |
（三）試驗方法
1．凝膠的選擇 根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28 或G500 ，G250 多用于分離蛋白質單體，G200 多用于分離蛋白質凝膠聚合體等。
2．凝膠的預處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定。
表 凝膠量與型號和層析柱大小與規格及凝膠用量
層析柱規格 | 凝膠的規格和用量（g） | |||||
直徑（cm） |
高（cm） |
容量（ml） |
G25 | G50 |
G100 |
G200 |
0.9 | 15 | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 | 0.3 |
0.9 | 30 | 19 | 5 | 2 | 1.2 | 0.6 |
0.9 | 60 | 38 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 20 | 40 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 40 | 80 | 20 | 8 | 5.0 | 2.4 |
1.6 | 70 | 140 | 35 | 14 | 9.0 | 4.4 |
1.6 | 100 | 200 | 50 | 20 | 12.5 | 6 |
2.6 | 40 | 210 | 50 | 20 | 12 | 7 |
2.6 | 70 | 370 | 90 | 35 | 20 | 12 |
2.6 2.6 | 100 60 | 530 1 000 | 130 250 | 50 110 | 30 70 | 17 35 |
為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復數次即可。
3．裝柱 層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5～1︰25；對于純化蛋白質來說應為1︰20～1︰100。
裝柱過程基本同離子交換層析柱。
4．加樣與洗脫 樣品體積不宜過多，最好為床體積的1％～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脫液收集 同離子交換層析。
6．凝膠柱的重復使用與保存 當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續使用。保存方法有三種：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2 N3 或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態下保存。
⑶ 長期不用者，最好以干燥狀態保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。
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