ELISPOT 發展歷史
簡介ELISPOT技術
ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下約10-20mm大小染色的斑點。
ELISPOT技術的過去
ELISPOT是20多年前便己研發成功的老技術。Czerkinsky 等人率先在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能率先將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內實驗的環境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內免疫系統即將進行的下游免疫反應。
ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質、呈色底膜的材質等幾個技術性的問題，使當時多數研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數據分析重現性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現較清晰的小色點。
第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如；
實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應？
斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？
能否相信斑點是由單一的細胞造成？ ? ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍？ ? 如果效應相互拮抗的cytokine同時產生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？
ELISPOT 技術的現在
1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術改良，ELISPOT 分析技術已經逐漸達到科研人員的期待，它已是當世公認最靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統的兩個重要參數：抗原特定T細胞的clone族群大小；和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。
多年來經過數十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般公認，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當的實驗設計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調節藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。
上圖：典型Elispot Plate Layout 右圖：實驗結果
ELISPOT分析技術的幾個特點已經讓它在抗原特定T細胞免疫學上獨占鰲頭。此技術是當世唯一準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內外常規的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環系統發生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當的效價，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構，病人血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術流程的規范化、標準化。
流式細胞intracellular cytokine技術之靈敏度僅是萬中取一
ELISPOT 斑點的判讀
像多數的Cell-based分析技術一樣，ELISPOT Cytokine技術也是相當耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學技術上的一大挑戰。ELISPOT結果的判讀常需要專聘、有經驗的技術員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統的顯微鏡計算斑點數仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。
科學實證的本質，在于如何使實驗結果能盡可能客觀、精確、同時有高重現性，傳統的人工計算法顯然無法達到此一要求。故而有幾個科研團隊使自行開發Plate Scanner與自動分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開發之ImmunoSpot? Analyzer自動分析儀最具代表性。分析ELISPOT實驗數據的過程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF?；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預料像ImmunoSpot? Analyzer這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，徹底解除ELISPOT分析技術的瓶頸問題，進一步推廣該技術的新穎應用。
ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數據格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數目、每個小孔中的平均斑點數目、每個小孔中斑點大小的直方統計圖。
ELISPOT 未來展望
據筆者的觀察，ELISPOT 分析技術正在歐美各國發揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫師手上的那張心電圖，經由這個技術科研人員可以在活體內直接進入一個器官系統，在那里視察、發掘，得到全新的智識。
從各國文獻可見ELISPOT技術已經達到標準化、規范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監視癌癥病人接受免疫療程時的反應(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內的一個特定的免疫反應型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術同時也在數個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃將是首次利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關研究。我們期待未來此一技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。
其它ELISPOT應用范圍
移植研究 ? allograft rejection
疫苗開發 -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響
Th0/Th1/Th2細胞轉換分析
自體免疫研究 免疫調節及免疫治療研究
癌癥研究 -腫瘤反應T細胞作用
過敏機制探討 IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參與過敏機制之細胞激素研究
傳染疾病研究 Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
抗原決定位定圖
體液免疫力研究 B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究
參考文獻：
Czerkinsky, C.C., L.A. Nilsson, H. Nygren, O. Ouchterlony, and A. Tarkowski. 1983. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J. Immunol. Meth. 65: 109.
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