SDS-聚丙烯胺凝膠的制備方法
（一） 試劑
1. 30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29 g
N，N’-亞甲雙丙烯酰胺 1 g
蒸餾 水 100 ml
加熱至50℃攪拌溶解，于4℃保存。
2．10%SDS： 蒸餾 水配制，室溫保存。
3．10%過硫酸銨：蒸餾水配制，4℃保存，一周內使用。
4．TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）
5．1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）和1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）
6．電泳緩沖液
25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
250 mmol/L 甘氨酸
0.1% SDS
7．電泳加樣緩沖液
50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8）
50 mmol/L 二硫蘇糖醇（ DTT ）
2 % SDS
1 % 溴酚藍
10 % 甘油
（二）操作
1．將玻璃板和墊片依次用5%的KOH甲醇溶液、去污劑和清水洗滌，晾干。將無凹口的玻璃板平放在桌面上；將墊片兩面涂少許凡士林后，排放在玻璃兩側，再將有凹口的玻璃板在墊片上放置妥當。將玻璃夾層推至桌沿，用膠帶紙封閉三個側面，留出有凹口的一面不封閉。
2．使玻璃夾層豎立，有凹口面朝上。根據所需的凝膠濃度和用量，按表7-1的比例配制分離膠溶液
3．一旦加入TEMED，混勻后立即小心將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，為積層膠留有足夠空間。用吸管輕輕在其頂層加入幾毫升異丁醇，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
4．聚合完成后（約30～60分鐘）后，倒掉覆蓋液體，用蒸餾水洗凝膠上部數次，盡可能用吸水紙吸干凝膠頂端的殘余液體
5．根據所需用量，按表7-2的比例配制積層膠溶液。
6．注入積層膠溶液，插入梳子，小心避免氣泡，垂直放置于室溫下。
7．在積層膠聚合完成（約30分鐘）后，小心拔掉梳子。用蒸餾水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。
8．將凝膠放入電泳槽中，上下槽均加入1×電泳緩沖液，檢查是否泄漏。驅除兩玻璃板之間凝膠底部的氣泡，即可上樣。
表7-1 配制SDS-PAGE凝膠電泳分離膠濃度與所用溶液量
溶液成分 | 5～50ml凝膠溶液中各成分所需體積（ml） | ||||||
10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 40 | 50 | |
12% 凝膠溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10%SDS 10%過硫酸胺 TEMED
15% 凝膠溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10% SDS 10%過硫酸胺 TEMED |
3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004
2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 |
4.9 6.0 3.8 0.15 0.15 0.006
3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.006 |
6.6 8.0 5.0 0.2 0.2 0.008
4.6 10.0 5.0 0.2 0.2 0.008 |
8.2 10.0 6.3 0.25 0.25 0.010
5.7 12.5 6.3 0.25 0.25 0.010 |
9.9 12.0 7.5 0.3 0.3 0.012
6.9 15.0 7.5 0.3 0.3 0.012 |
13.2 16.0 10.0 0.4 0.4 0.016
9.2 20.0 10.0 0.4 0.4 0.016 |
16.5 20.0 12.5 0.5 0.5 0.020
11.5 25.0 12.5 0.5 0.5 0.020 |
表7-2 配制 SDS -PAGE凝膠電泳積層膠所用溶液量
溶液成分 | 1～10ml凝膠溶液中各成分所需體積（ml） | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 | |
H 2 0 30%丙烯酰胺 1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%過硫酸胺 TEMED | 0.68 0.17 0.13 0.01 0.01 0.001 | 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 | 2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.004 | 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 | 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.006 | 5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 | 6.8 1.7 1.25 0.1 0.1 0.010 |
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