酵母三雙雜交系統(tǒng)
三雜交系統(tǒng)(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA間的相互作用。Senguptaxi等首先報道了應(yīng)用三雜技系統(tǒng)分析金屬調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)與金屬反應(yīng)元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV轉(zhuǎn)錄激活蛋白(trans-activator protein， Tat)與HIV轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列間的作用。
三雜交系統(tǒng)的基本原理是將一個已知的RNA結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合domain(如LexA)構(gòu)建第一個融合蛋白，第二種蛋白(待選的RNA結(jié)合蛋白)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合蛋白。此外構(gòu)建和表達(dá)一雜合RNA，含有二個不同的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)RNA與二個RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)相互作用時可激活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。如Dhruba等在IRP1與IRE的RNA相互作用的研究中，第一個RNA結(jié)合蛋白選用噬菌體MS2被殼蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可識別RNA中的21nt的莖環(huán)序列，并與之有較高的親和力。將其與LexA融合構(gòu)建雜合蛋白。IRP1與Gal4的激活結(jié)構(gòu)域(activation domain)融合構(gòu)建另一個雜合蛋白。IRE mRNA在非編碼區(qū)有21nt的莖環(huán)區(qū)序列，編碼區(qū)編碼與IRP1特異性結(jié)合的蛋白序列。在實(shí)驗(yàn)中他們用一質(zhì)粒表達(dá)雜交RNA，含2個MS2 coat protein結(jié)合位點(diǎn)和1個IRE。
三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。與雙雜交系統(tǒng)相比，雜交RNA與雜交蛋白有些不同：首先，雜交RNA分子可能不是生理結(jié)構(gòu)，雜交的不同RNA組分對正常結(jié)構(gòu)會有一定影響。但Dhruba的研究表明，局部、相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)區(qū)如MS2 coat protein，IRP1識別位點(diǎn)等可在體內(nèi)共存于同一雜交RNA分子中。其次，這些RNA中的莖環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，RNA只要形成部分正確結(jié)構(gòu)，則足以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用。
象雙雜交系統(tǒng)一樣，三雜交系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用。
〈1〉應(yīng)用此系統(tǒng)可分析確定RNA--蛋白作用的精確結(jié)構(gòu)域，甚至單個核苷酸或氨基酸殘基。
〈2〉用于鑒定和克隆識別結(jié)合有重要生理功能RNA(如轉(zhuǎn)錄、定位、RNA病毒包裝和感染等)的蛋白質(zhì)，可用于調(diào)控的機(jī)理研究、疾病的防治以及抗病毒藥物的研制開發(fā)。
〈3〉通過構(gòu)建雜交RNA庫，可篩選與特定蛋白結(jié)合的RNA。
〈4〉有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)展四雜交系統(tǒng)研究RNA-RNA間的相互作用。
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