煮沸法快速提取質(zhì)粒以及瓊脂糖電泳與DNA酶解
一． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong> ：
1、 掌握質(zhì)粒 DNA 分離，純化的原理
2、 學(xué)習(xí)煮沸法快速提取質(zhì)粒 DNA 的方法
3、 學(xué)習(xí) DNA的限制性酶切的基本技術(shù)
4 、 學(xué)習(xí)利用瓊脂 糖電泳測(cè)定 DNA片段的長(zhǎng)度
二、 實(shí)驗(yàn)原理
在基因工程 中， DNA 分子的切割是由限制性內(nèi)切酶來(lái)完成的。限制性內(nèi)切酶能識(shí)別特定的 DNA 序列，在一定的條件下切斷雙鏈 DNA 。限制性內(nèi)切酶的作用效率是受多方面因素影響的，如反應(yīng)溫度，緩沖體系，離子種類與濃度， DNA 的純度和甲基化程度等。對(duì) DNA 進(jìn)行酶切時(shí)，首先要選擇適合的緩沖液。對(duì)于單酶切，應(yīng)選用該酶的最適緩沖液；對(duì)于雙酶切或三酶切，應(yīng)選用一種能使所有酶都充分作用的緩沖液。 DNA 的純度對(duì)于酶切的效果的影響也很大，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)。酚。氯仿。 SDS 等雜質(zhì)都會(huì)抑制限制性內(nèi)切酶的活性。
瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定和純化 DNA 片段的常規(guī)方法。利用低濃度的熒光嵌入染料 - 溴化乙錠進(jìn)行染色，可確定 DNA 在凝膠中的位置。如有必要，還可以從凝膠中 回收 DNA 條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。長(zhǎng)度 100kb 或更大的 DNA ，可以通過(guò)電場(chǎng)方向呈周期性變化的脈沖電場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行分離。
在基因工程的常規(guī)操作中，瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用最為廣泛。它通常采用水平電泳裝置，在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下進(jìn)行電泳。 DNA 分子在凝膠緩沖液（一般為堿性）中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。 DNA 分子遷移的速率受分子大小，構(gòu)象。電場(chǎng)強(qiáng)度和方向，堿基組成，溫度和嵌入染料等因素的影響。
三 ． 實(shí)驗(yàn)材料和試劑：
1． 菌種： 含 pUC18 的大腸桿菌 JM107 菌株。
2． 化學(xué)試劑和溶液
（1） LB 培養(yǎng)基：
NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l
胰蛋白胨 10g/l 氨芐青霉素 50 μ g/ml （培養(yǎng)基滅菌后加入）
pH7.0
（2） 70% 乙醇（ -20 ℃）及無(wú)水乙醇（ -20 ℃）
（3） STET 緩沖液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）
（4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）
（5） 1.2M 氯化鈉
（6） TE 緩沖液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）
（7） 電泳緩沖液（ 50XTAE ）
Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml
使用時(shí)用蒸餾水稀釋 50 倍。
（8） 樣品緩沖液（ 6X ）
0.25% 溴酚藍(lán)， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖
（9） 溴化乙錠 10mg/ml
（10） 瓊脂糖（電泳級(jí)）
（11） 限制性內(nèi)切酶
（12） 溶菌酶（ 50mg/ml ，溶于 10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ）
3.儀器設(shè)備:
臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱等。
Eppendorf 離心管， Tip 頭，三角瓶等滅菌備用。
電泳儀，電泳槽，樣品梳，微波爐，水浴鍋，移液器（ 20ul, 200ul 和 1000ul ），離心管， Tips(200ul,1000ul) 。
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