動物血中超氧化物歧化酶的提取和活性測定
[原理]
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，簡稱 SOD)廣泛存在于生物體內的含Cu、Zn、Mn、Fe的金屬類酶。它作為生物體內重要的自由基清除劑，可以清除體內多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(0 2 - )是人體氧代謝產物，它在體內過量積累會引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內許多疾病的發生和形成有關。由于SOD能專一消除超氧陰離子(O 2 - )而起到保護細胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應用前景，并引起了國內外醫藥界、生物界和食品界的極大關注。
按金屬輔基成分的不同可分成3種類型。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD)，主要存在于真核細胞的細胞質中，在高等植物的葉綠體基質、類囊體內以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量約為3.2×10 4 ，純品呈藍綠色，每個酶分子由2個亞基通過非共價鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中，在植物的葉綠體基質和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-S0D，過去一直認為只存在于原核細胞中，近來發現有一些真核藻類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數情況下每一個二聚體中含有一個Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類和含量也有很大差別。迄今為止人們已從細菌，真菌、原生動物。藻類、昆蟲、魚類、植物和動物等各種生物體內分離得到SOD。為拓寬提取SOD的原料，篩選或基因過程開發產SOD量較高的菌株。目前，研究開發最多的資源還是從動物血液、動物組織中制備提純SOD。
SOD的活力測定方法很多，常見的有化學法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學法應用最普遍，化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產生有色中間物和O 2 - ，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用?；瘜W發光法和光化學擴增法不適用于測定Mn-SOD，但對于Cu/Zn-SOD反應極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測定結果穩定，重復性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊 儀器 ，實際應用受到限制。亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結合，應用于Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數倍，而且專一性強，重復性好，操作方便，不需要特殊 儀器 和設備，易于實際應用和推廣，是目前較好的測定方法之一。
在一般情況下，SOD酶活性測定只能應用間接活性測定法。本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法。
鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O 2 - ，生成帶色的中間產物，反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內，中間物在420nm波長出有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O 2 - 與H + 結合生成O 2 和H 2 O 2 ，從而阻止了中間產物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。
酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。
[方法和步驟]
1、從豬血中提取SOD
（1） 分離血球
取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4 000r/min離心20min，收集紅血球。
（2）除血紅蛋白
紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4 000r/min離心20min，重復三次，然后向洗凈的紅血球加入1～1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預冷95%乙醇和0.15倍體積的預冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4 000r/min離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。
（3）熱變性
上清液加熱到65℃，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3 000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。
（4）沉淀
清液在鹽冰浴中冷卻，然后在-5℃以下的操作溫度下，加入1.5倍量預冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產生，靜置2～3min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4 000r/min離心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K 2 HPO 4 -KH 2 PO 4 緩沖液透析，即得粗SOD溶液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。
2、SOD酶活性測定
（1）鄰苯三酚自氧化速率的測定
取兩支試管按下表加入25℃預熱過的緩沖液,然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數一次，測定4min內每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
試劑 | 空白管（mL） | 自氧化管（mL） |
pH8.2、50mmol/L Tris-HCl | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
（2）、SOD樣液的活性測定
樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。
試劑 | 空白管（mL） | 樣品管（mL） |
pH8.2、50mmol/L Tris -HCl | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | - |
SOD樣液 | - | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
（3）計算
3、蛋白質濃度測定
[結果與計算]
1、 計算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白濃度和比活力。
2、計算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和純化倍數。
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