晶狀體醛糖還原酶測(cè)定方法的具體步驟
熒光法：血樣1mI，加肝素抗凝管，1500g離心10分鐘，紅細(xì)胞用10倍體積的等滲鹽水沖洗三次，加4倍體積10mmol/l的磷酸鉀緩沖液(pH6．o)，振蕩10分鐘，使之完全溶血，然后溶血液以10，000g離心30分鐘，以除去細(xì)胞有形成份。
活活性熒光法測(cè)定步驟：AR活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括以下成分(最終濃度)：67mmol/l的鈉—鉀磷酸緩沖液(pH 7.0)，0.2mol/l 硫酸銨，0．1mmol/lNADPH，10mmol/l DL-甘油醛和紅細(xì)胞溶血液10ul,總體積1.0ml.空白管以雙蒸水代替DL—甘油醛。
在37℃水浴反應(yīng)5分鐘后加0.3mol/l的NAOH2ml終止反應(yīng)。充分混勻后60℃加熱15分鐘，破壞NADPH然后加11．8mol/l NAOH[內(nèi)含0.1％H2O2) 3.0ml充分混勻，經(jīng)37℃保溫60分鐘后在367／455M條件下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，再從事先繪制的NADPH熒光測(cè)定工作曲線上讀出NADPH含量。
l單位(U)酶活性表示一分鐘內(nèi)1ummlo NADPH被氧化的酶量，每份標(biāo)本的AR活性用U／gHb表示。
ELISA法：血約1m1置肝家防凝管，10叨8離心15分鐘，吸去血清后紅細(xì)跑用3倍體積的磷酸鹽／氯化鈉溶液(100mmol／L磷酸鉀／145mm0l/l氯化鈉，v／v＝9：1)沖洗三次，加等體積10mmol/l的磷酸緩沖液(ph 7.0)在15000g離心15分鐘，棄去沉淀后，溶血液用于測(cè)定。
抗體—夾心ELISA：免疫酶標(biāo)扳[Max—isorpF96 Nunc)用50ul純化抗體(10mg/ml，稀釋于50mmol/l．ph9．6的碳酸緩沖液)室溫下包被2小時(shí)，用沖洗液[0．9％的氯化鈉, 0．05％的吐溫20)沖洗三次，加100ul阻斷液(170mmol/l硼酸，120mmol/lL的氯化鈉, 005％的吐溫20，lmmol/l的EDTA, 025％的牛血清白蛋白和0.05％的迭氮鈉，pH8．5)室溫下阻斷30分鐘。
各孔加入50ul阻斷液適當(dāng)稀釋的抗原(AR)于4℃振蕩孵育10小時(shí)，然后沖洗三次，加50ul的HRP—交聯(lián)抗體(10ul/ml)室溫振蕩孵育2小時(shí)，徹底沖洗后，加75ul的底物(0.42mmol/L的3．3’，5，5’—四甲基苯胺，0．6mmol/L的H202，溶入0.1m以／L的枸掾酸緩沖液PH5.0)于25℃顯色20分鐘，加2mol/l的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定oD值。己知旦的純化酶(AR)稀釋成系列濃度。
建立標(biāo)準(zhǔn)直線方程，未知樣本復(fù)管測(cè)定，根據(jù)其平均oD值與標(biāo)準(zhǔn)直線比較，求取AR水平。每份標(biāo)本AR水平用ng／gHb表示。
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