Western印跡鑒定目標蛋白
【實驗目的】
1.了解western blot 的原理及其意義，掌握Western blot的操作方法；
2.應用Western blot 技術分析鑒定經SDS-Page 分離后轉移到尼龍膜上的重組蛋白。
【實驗原理】
Western印跡法簡稱蛋白質印跡法。蛋白質樣品經 SDS-PAGE電泳后，凝膠所含的樣品蛋白質區帶通過電泳方法轉移、固定到載體（如尼龍膜、硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價鍵的形式與蛋白質結合，從而固定住蛋白質；以膜上的蛋白或多肽為抗原 ，與相應的第一抗體起免疫反應，再和酶標記或同位素標記的第二抗體反應，用適當的溶液漂洗去未結合抗體后，置含底物的溶液中溫育，或通過放射自顯影顯出譜帶，即可檢測出樣品中的特異蛋白組分。
【試劑與器材】
(一)試劑
1.轉移緩沖液：2.9g 甘氨酸（39 mmol/L），5.8g Tris 堿（48mmol/L），0.37g SDS（0.037%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；
2.封閉液：5% 脫脂奶粉，0.02% 疊氮鈉，溶于PBST溶液中；
3.麗春紅S（Ponceaus）染液：0.5g 麗春紅S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；
4.PBST洗膜液： PBS 緩沖液含0.5% Tween 20；
5．DAB濃縮顯色液（50X）：DAB（二氨基聯苯胺）是根過氧化物酶的底物之一，臨用前稀釋。
6．5 x PBS( 磷酸緩沖液 )：在1600mL蒸餾水中溶解82.3g Na 2HPO4 , 20.4g Na H2PO4, 40g Na Cl, 用0.1mol/L NaOH調pH至7.4，加水定容至2升。高壓滅菌20 分鐘，室溫保存。用前稀釋至1x 。
7．SDS-PAGE電泳用溶液和試劑。
(二)器材
1.SDS-PAGE電泳裝置一套;
2.電轉移膜裝置
3.抗體-酶反應搖床
【操作方法】
〈一〉電轉移
1．將蛋白質樣品進行SDS-PAGE，待溴酚藍跑出膠后停止電泳（1）。
2．載手套切6-8張定性濾紙和一張尼龍膜，它們的大小應與凝膠的大小相同。在尼龍膜的一（左）角作一記號（或剪角），與濾紙和海棉（纖維）墊浸泡于轉移緩沖液中。
3．剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號（2）。
4．按下圖示制備“夾心餅”，打開電極板，在一邊放上一塊纖維墊，再依次往上疊加3-4張濾紙，將凝膠輕放于濾紙上。再將一張NC膜放上，加上3-4張濾紙，每加上一種物品都要精確對齊，并確保沒有氣泡(3)。再鋪上纖維墊，最后將電極板夾上，夾上夾子插進轉膜槽中。
5．按上示意圖，接上電源（凝膠一邊接負極，尼龍膜一邊接正極），恒流電泳1.5小時， 0.8mA/cm2 膜。
6．關閉電源，將尼龍膜取出，置塑料盒中用麗春紅S染色約5分鐘，回收麗春紅S，然后用蒸餾水洗去背景染料顯色，室溫稍干燥后用鉛筆描下 Marker所在位置，然后用PBST浸泡幾次，完全洗去麗春紅S染料（4）。
〈二〉封閉
7．將膜放入塑料盒中，加入20mL封閉液，置脫色搖床中緩慢搖動，室溫1小時或4℃封閉過夜（5）。〈三〉靶蛋白與第一抗體結合
8 棄去封閉液，加入含有第一抗體的封閉液5～10mL，室溫平緩搖動溫育3小時。然后盡量回收抗體溶液，- 20℃ 保存，可重復使用（6）。
9．用PBST室溫洗膜3次，每次10 min（7）。
〈四〉與第二抗體反應
10.棄去PBST溶液，加入適量（～5-10mL）含有第二抗體的封閉液，室溫下平緩搖動溫育1小時（8），盡量回收第二抗體。
11．用PBST溶液漂洗尼龍膜3次，每次10鐘。
〈五〉顯色
12．把尼龍膜置于稀釋50倍的DAB溶液中，輕輕搖動，顯色約10－30 min，待蛋白帶的顏色深度達到要求后，用水漂洗，最后轉移至PBS溶液中，拍照或掃描（9）。
【注意事項與提示】
（1）電泳時間要根據目標蛋白大小而定。
（2）為避免干燥，可在膠上滴轉膜緩沖液或浸泡在轉膜緩沖液中，使其離子強度和pH值與轉膜緩沖液一致。
（3）可用一圓棒在濾紙上來回滾動以驅除氣泡。
（4）染色后整張膜呈紅色，由于麗春紅S與膜上蛋白的結合很不緊密，因此脫背景色時要注意觀察，勿將紅色的蛋白帶也洗去；脫色完畢，觀察轉移效果，并用鉛筆在分子量標準帶處做上記號。 如果用預染的Marker，則不需要用麗春紅染色。
（5）封閉液的作用是封閉膜上沒有蛋白帶的部位，以減少抗體的非特異結合；我們推薦4℃封閉過夜。
（6）抗體的用量以浸沒尼龍膜為準，用封閉液稀釋第一抗體，抗體的稀釋度要由預實驗來定，下列數值可作為參考：多克隆抗體：1：100到1：5000 小鼠腹水：1：1000到1：10 000
（7）PBS對膜上的蛋白沒有影響，但可洗去剩余的封閉液和其它雜質；Tween 20 是一種非離子型去污劑，含適當濃度Tween 20的PBST可洗去非特異結合的抗體，使整張膜的背景更清晰。
（8）一般所用的第二抗體（抗免疫球蛋白或蛋白質A）為酶標抗體，如辣根過氧化物酶標抗體或堿性磷酸酶標抗體。第二抗體的稀釋度一般為：1：200到1：2000。本實驗中第一抗體為鼠源單克隆抗體，因此二抗應選擇兔抗鼠抗體，若一抗為兔源多克隆抗體，二抗應選擇羊抗兔抗體。
（9）DAB有致突變之嫌，因此要戴手套操作；辣根過氧化物酶顯色的條帶在陽光下幾個小時就會褪色，因此要盡快拍照。
【實驗安排】
試劑配制－電泳－轉移：1天；
雜交－顯色－結果處理：約1天。
【實驗報告要求與思考題】
1．用數碼相機拍下麗春紅S染色和最后抗體顯色的結果，計算目標蛋白的分子量，并對結果加以分析。
2．對實驗中出現的其它問題進行分析討論。
3．進行凝膠電泳時應如何選擇樣品點樣，設置對照？
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