核酸的定量測(cè)定:定磷法
一、目的：
掌握定磷法測(cè)定核酸的含量。
二、原理：
在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，當(dāng)有還原劑存在時(shí)磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變藍(lán)色的還原產(chǎn)物——鉬藍(lán)
鉬藍(lán)最大的光吸收在650—660nm波長處。當(dāng)使用抗壞血酸為還原劑時(shí)，測(cè)定的最適范圍為1—10微克無機(jī)磷。
測(cè)定樣品核酸總磷量，需先將它用硫酸或過氯酸消化成無機(jī)磷再行測(cè)定。總磷量減去未消化樣品中測(cè)得的無機(jī)磷量，即得核酸含磷量，由此可以計(jì)算出核酸含量。
三、器材及試劑：
1．器材：
①分析天平。
②容量瓶（50及100毫升）。
③臺(tái)式離心機(jī) 。
④離心管。
⑤凱氏燒瓶（25毫升）。
⑥恒溫水浴鍋。
⑦200℃烘箱。
⑧硬質(zhì)玻璃試管。
⑨吸量管。
⑩分光光度計(jì) 。
2．試劑：
以下試劑均用分析純，溶液要用重蒸水配制。
①標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：將分析純磷酸二氫鉀（KH2PO4）預(yù)先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器內(nèi)使溫度降到室溫，精確稱取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至50毫升（含磷量為1毫克/毫升），作為貯存液置冰箱中待用。測(cè)定時(shí)，取此溶液稀釋100倍，使含磷量為10微克/毫升。
②定磷試劑3mol·L-1硫酸∶水∶2.5%鉬酸銨∶10%抗壞血酸=1∶2∶1∶1（體積比）]：配制時(shí)按上述順序加試劑。溶液配制后當(dāng)天使用。正常顏色呈淺黃綠色，如呈棕黃色或深綠色不能使用，抗壞血酸溶液在冰箱放置可用1個(gè)月。
③沉淀劑：稱取1克鉬酸銨溶于14毫升70%過氯酸中，加386毫升水。
④5mol·L-1硫酸。
⑤30%過氧化氫。
四、操作步驟：
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取12支洗凈烘干的硬質(zhì)玻璃試管，按下表加入標(biāo)準(zhǔn)磷溶液、水及定磷試劑，平行作兩份。
將試管內(nèi)溶液立即搖勻，于45℃恒溫水浴內(nèi)保溫25分鐘。取出冷卻至室溫，于660nm處測(cè)定光密度。
取兩管平均值，以標(biāo)準(zhǔn)磷含量（微克）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．測(cè)總磷量：取4個(gè)微量凱氏燒瓶，1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)各加0.5毫升蒸餾水作為空白對(duì)照，3、4號(hào)各加0.5毫升制備的RNA溶液（約3毫克RNA），然后各加1.0—1.5毫升5mol·L-1硫酸。將凱氏燒瓶置烘箱內(nèi)。于140—160℃消化2—4小時(shí)。待溶液呈黃褐色后，取出稍冷，加入1—2滴30%過氧化氫（勿滴于瓶壁），繼續(xù)消化，直至溶液透明為止。取出，冷卻后加0.5毫升蒸餾水，于沸水浴中加熱10分鐘，以分解消化過程中形成的焦磷酸。然后將凱氏燒瓶中的內(nèi)容物用蒸餾水定量地轉(zhuǎn)移到50毫升容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度。
取4支硬質(zhì)玻璃試管，分成兩組，分別加入1毫升上述消化后定容的樣品和空白溶液，如前法進(jìn)行定磷比色測(cè)定。測(cè)得的樣品光密度減去空白光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出磷的微克數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中的總磷量。
3．測(cè)無機(jī)磷量：取4支離心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制備的RNA溶液，然后于4支離心管中各加0.5毫升沉淀劑，搖勻，以3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷試劑，同上法比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出無機(jī)磷的微克數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中的無機(jī)磷量。
五、結(jié)果與討論：
1．繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．計(jì)算
RNA的含磷量為9.5%，因此可以根據(jù)磷含量計(jì)算出核酸量，即1微克RNA磷相當(dāng)于10.5微克RNA。將測(cè)得的總磷量減去無機(jī)磷量即RNA磷量。如樣品中含有DNA時(shí)，RNA磷量尚需減去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均為9.9%。
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