DNA電鏡技術(shù)及其應(yīng)用
關(guān)鍵詞： DNA 電鏡技術(shù) 應(yīng)用
電子顯微鏡作為一種研究工具在核酸研究中已發(fā)揮很大作用并日益受到重視。1859年人們首先發(fā)現(xiàn)核酸為活體組織細(xì)胞核的主要組成成分，90年后又在電鏡下觀察到單個(gè)核酸分子，而Avery等于1944年發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳的分子基礎(chǔ)后，更激起人們了解核酸物理結(jié)構(gòu)的興趣。1959年Aleinschmedt及Zahn建立了一種新的電鏡技術(shù)，即細(xì)胞色素C展層技術(shù)(又稱堿性蛋白 膜技術(shù)及Kleinschmice-Zahn技術(shù))，并成功地在電鏡下觀察到雙鏈DNA (dsDNA )分子，開(kāi)始了應(yīng)用電子顯微鏡研究DNA 結(jié)構(gòu)和功能的新時(shí)代［1］。以后經(jīng)過(guò)方法學(xué)上的不斷改進(jìn)，又發(fā)展了許多新的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于DNA 結(jié)構(gòu)與功能以及蛋白 質(zhì)-DNA 相互作用的研究。我們參閱了近三十多年的有關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室從事核酸電鏡技術(shù)研究的體會(huì)，就DNA 電鏡的常用技術(shù)及其基本應(yīng)用加以介紹。
1 DNA 電鏡樣品制備方法
1.1 細(xì)胞色素C展層技術(shù)(堿性蛋白 膜技術(shù))［2，3］ 溶液中的DNA 分子呈三維無(wú)規(guī)則超卷曲狀態(tài)，電鏡觀察前必須將DNA 分子變?yōu)槎S伸展?fàn)顟B(tài)非聚集分子。細(xì)胞色素C展層技術(shù)的原理就是將DNA 溶液與堿性蛋白 (細(xì)胞色素C)混合，帶負(fù)電的DNA 分子非特異性吸附大量細(xì)胞色素C，而后者具有在水或低鹽溶液表面變性形成單層膜的特性，這時(shí)纏繞其中的DNA 分子也隨之展開(kāi)呈二維伸展?fàn)顟B(tài)。將變性劑(如甲酰胺等)加入展開(kāi)液中，可以防止單鏈DNA 分子內(nèi)堿基非隨機(jī)配對(duì)。細(xì)胞色素C展層技術(shù)不僅可以用于觀察雙鏈DNA 分子(dsDNA )，也可用于觀察單鏈DNA 分子(ssDNA )，此時(shí)該方法也可稱甲酰胺展層技術(shù)。展開(kāi)液(上相液)中含0.1～0.5 μg/ml的DNA 分子，0.1～0.25 mg/ml的細(xì)胞色素C，40%～60%的甲酰胺，緩沖液的pH為8.5。展開(kāi)液沿斜面流至下相液(蒸餾水或10%甲酰胺，10 mM Tris*HCL, 1mM EDTA pH8.5)上展開(kāi)，爾后用覆有支持膜的銅網(wǎng)取樣。單鏈DNA 分子用此法也能較好地展開(kāi)，其直徑稍細(xì)，形態(tài)較為曲折。下相液中甲酰胺濃度比上相液中低30%，緩沖液離子濃度為上相液中的10%。
1.2 擴(kuò)散方法［4］ 擴(kuò)散方法是堿性蛋白 膜技術(shù)的一種變化形式，其原理是堿性蛋白 在含DNA 的下相液表面形成單層蛋白 膜，DNA 分子通過(guò)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)與蛋白 膜接觸并吸附其上。該方法可以大大減緩展層過(guò)程中的剪切力，尤其適用于較長(zhǎng)的DNA 分子。其制樣過(guò)程為：配制混液，將20 ng/ml的DNA ，0.2M醋酸胺(pH6.0)，加于小塑料平皿中；將一細(xì)針頭蘸取細(xì)胞色素C粉末輕輕觸及下相液表面，靜置10～30 min，使DNA 擴(kuò)散并吸附到蛋白 膜上，用銅網(wǎng)取樣。對(duì)此方法進(jìn)一步簡(jiǎn)化，建立了一步吸附法。配制DNA 及細(xì)胞色素C混合液，細(xì)胞色素C形成單層膜的同時(shí)，DNA 分子經(jīng)過(guò)擴(kuò)散與對(duì)流吸附其上，靜置4～5 min，銅網(wǎng)取樣。DNA 的吸附量與其濃度及大小有關(guān)，與(時(shí)間)3/2成正比。該方法的優(yōu)點(diǎn)是所用DNA 量較少，另外在展開(kāi)單鏈DNA 時(shí)可加入50%甲酰胺。
1.3 無(wú)蛋白 展層技術(shù) 細(xì)胞色素C(Mr12 000)掩蓋了DNA 分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)及其結(jié)合的蛋白 。Vollenweider等［5］用小相對(duì)分子質(zhì)量的陽(yáng)離子去垢劑苯二甲基芐基氯化胺(BAC，Mr350)取代細(xì)胞色素C，建立了無(wú)蛋白 展層技術(shù)(亦稱BAC方法)。制備蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合物標(biāo)本，先用甲酰胺配制2 mg/ml苯二甲基芐基氯化胺的貯存液，將1～2 mg/ml的DNA 用緩沖液或展開(kāi)液稀釋50倍，取20 μl在蒸餾水上展開(kāi)。上述方法對(duì)技術(shù)條件變化敏感，下相液所用水必須為新蒸餾水或超純水并經(jīng)快速預(yù)冷。取樣時(shí)最好用處理過(guò)的碳膜。處理方法有輝光放電［6］、溴化乙錠(EB)［7］、多聚賴氨酸(Mr2 000)及Alcian blue等。
Thomas［8］用anthrabis取代細(xì)胞色素C，也建立了一種地蛋白 展層技術(shù)，認(rèn)為對(duì)dsDNA 、ssDNA 及蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體的制樣效果優(yōu)于BAC方法，該方法所用上相液中含有0.1 μg/ml的DNA 、0.01%的Anthrabis、30%的甲酰胺及緩沖液(pH8.5)，經(jīng)擴(kuò)散方法取樣。此外，SDS、EB及二價(jià)陽(yáng)離子等亦曾用于無(wú)蛋白 制樣技術(shù)。Griffiths對(duì)蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體的電鏡研究亦有詳細(xì)描述［9］。
1.4 低溫電鏡DNA 標(biāo)本的制備 低溫電鏡(Gryoelectron microscopy)一直被認(rèn)為是生物電子顯微術(shù)中最有希望獲得生物標(biāo)本自然結(jié)構(gòu)的手段。其理論基礎(chǔ)是基于防止純水或溶液經(jīng)快速冷凍后冰晶的形成。水結(jié)冰有三種相變形式：常壓下-70℃至-130℃形成三角形冰晶，-120℃至-140℃形成立方形冰晶，而-160℃以下形成無(wú)定形冰，即玻璃態(tài)冰。快速冷凍后DNA 樣品中的水直接變?yōu)椴ＡB(tài)冰，可以避免因形成冰晶造成結(jié)構(gòu)損傷。在微篩支持膜上制備玻璃態(tài)含水的DNA 樣品，加一套減少電子輻射損傷的電鏡技術(shù)和相襯成相方法，可以獲得高分辨率的近于自然狀態(tài)的DNA 結(jié)構(gòu)圖像。該方法也避免了傳統(tǒng)電鏡制樣時(shí)脫水、固定、吸附、染色、噴鍍等處理對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞。其制樣方法為：將3 μl的DNA 溶液(200 μg/ml)置于覆有微篩支持膜的銅網(wǎng)上，吸去多余液體，迅速將銅網(wǎng)浸入液氮預(yù)冷的液體乙烷中，經(jīng)低溫傳輸裝置轉(zhuǎn)移到冷凍樣品臺(tái)或儲(chǔ)存于液氮中。為獲得DNA 樣品的高質(zhì)量圖像，要選擇合適的微篩孔徑及樣品厚度，微篩的制備可用Murray建立的方法。
1.5 試劑 細(xì)胞色素C和甲酰胺是DNA 電鏡技術(shù)中最重要的試劑。不同型號(hào)的細(xì)胞色素C展開(kāi)效果不同，有必要對(duì)不同的產(chǎn)品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以選擇最好的產(chǎn)品。為使DNA 電鏡圖象背景平滑、均勻，可用溴化氰(CNBr)將細(xì)胞色素C劈開(kāi)［10］：將20 mg/ml細(xì)胞色素C，用1 ml0.1N HCl及30 mg溴化氰(CNBr)混勻，室溫過(guò)夜處理，經(jīng)Sephadex G50層析柱純化。上相液中甲酰胺的質(zhì)量對(duì)展開(kāi)效果影響很大，應(yīng)經(jīng)純化［11］或去離子處理［12］。
1.6 支持膜［13］ 細(xì)胞色素C展層技術(shù)中常用火棉膠膜，新制備的膜吸附性能及反差效果最好。無(wú)蛋白 展層技術(shù)使用碳膜最好，碳膜較穩(wěn)定，污染小，但制備較火棉膠膜困難。低溫電鏡則需特殊的微篩支持膜。
1.7 染色及噴鍍 重金屬染色及小角度旋轉(zhuǎn)噴是增加DNA 分子反差的重要手段。染色一般用0.05 M HCl配制的0.05 M醋酸鈾溶液，使用時(shí)用90%乙醇稀釋1 000倍。金屬噴鍍常用鈀銥合金，以7～10℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)噴鍍，可使DNA 分子獲得足夠反差。
2 長(zhǎng)度測(cè)量
DNA 電鏡技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)是能從混合分子群體中顯示單個(gè)DNA 分子的特征，并且利用電鏡測(cè)量DNA 分子大小，常比其他方法更為準(zhǔn)確。DNA 分子大小過(guò)去常用分子量(dalton)或堿基(bp)表示。1bp的DNA 約為(2.08±0.03)×106 daltons［14］，相當(dāng)于3.14 kb。根據(jù)電鏡圖像DNA 的長(zhǎng)度，即可粗略計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量大小。樣品在展開(kāi)過(guò)程中展開(kāi)力對(duì)DNA 的作用及測(cè)量誤差會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響。為排除這些因素的影響，制樣時(shí)應(yīng)加入已知相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 分子作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)長(zhǎng)度比值，也可精確地計(jì)算出DNA 的長(zhǎng)度大小。常用作標(biāo)準(zhǔn)的DNA 分子有SV40、pBR322、Φx174RFⅡ、fd DNA 等。線性DNA 分子一般不能用作標(biāo)準(zhǔn)。制樣時(shí)加入已知濃度及大小的DNA 電鏡下也可精確測(cè)定DNA 濃度。這些測(cè)定僅需5 μg DNA 。
3 DNA ∶DNA 異源雙鏈繪圖
異源雙鏈方法可以檢測(cè)不同類型DNA 分子間的同源序列。將兩種DNA 分子進(jìn)行堿變性或熱變性后退火，同源序列部分雜交呈雙鏈結(jié)構(gòu)，非同源部分不能配對(duì)，在甲酰胺存在情況下維持雙鏈狀態(tài)，電鏡下可顯示三種結(jié)構(gòu)特征：
(1)除插入或缺失外，在兩種DNA 分子均相同時(shí)，插入或缺失部分在雙股異源雙鏈分子中呈單鏈插入/缺失環(huán)；
(2)兩種相同的DNA 分子某一區(qū)域?yàn)槠渌蛄腥〈娲鷧^(qū)域形成兩股不能配對(duì)的單鏈(即替代環(huán))；只有小段DNA 相同時(shí)，則形成一短的雙股區(qū)，兩側(cè)為不能配對(duì)的單鏈；(3)許多單個(gè)堿基不同的兩種DNA 分子形成間隔異源雙鏈含一系列單鏈及雙鏈區(qū)，電鏡下可以確定其位置及長(zhǎng)度，能識(shí)別50～100 bp長(zhǎng)的缺失/替代環(huán)。異源雙鏈方法已成功用于噬菌體［15］及病毒［16］DNA 缺失、替代、插入、重復(fù)區(qū)域的定位及長(zhǎng)度測(cè)量，闡明了爪蟾的rDNA 基因及間隔子的排列［17］，發(fā)現(xiàn)了側(cè)枝移動(dòng)現(xiàn)象［18］，確定了Ig可變區(qū)的編碼區(qū)域［19］。
4 標(biāo)記方法
細(xì)胞色素C及無(wú)蛋白 展層技術(shù)很難觀察到結(jié)合于DNA 上的相對(duì)分子質(zhì)量小于50 000的蛋白 ，也不能識(shí)別小于100 bp的DNA ∶DNA 或RNA∶DNA 雜交體。但如果將電子致密物鐵蛋白 或膠體金標(biāo)記到目的分子上再用傳統(tǒng)方法制樣即可解決此問(wèn)題。
鐵蛋白 (Mr 900 000)具有電子致密核心，可以用化學(xué)方法直接偶聯(lián)到核酸分子的3′末端［20］。由于鐵蛋白 分子較大，會(huì)損害探針的生物特異性及結(jié)合活性，因此利用生物素-(鏈霉)親和素的高親和反應(yīng)性，建立了間接標(biāo)記方法。生物素(Mr244)比鐵蛋白 小得多，可與親和素［Mr 68 000］或鏈霉親和素(Mr 68 000)高親和力結(jié)合。生物素可以偶聯(lián)到抗體和其他蛋白 上［21］；生物素化核苷酸可以摻入核酸分子內(nèi)［22］或加到RNA的3′末端。生物素化分子與偶聯(lián)鐵蛋白 的親和素或鏈霉親和素結(jié)合后即可在電鏡下進(jìn)行觀察。利用此技術(shù)成功地進(jìn)行了DNA 剪切修復(fù)區(qū)的觀察［23］及DNA 末端標(biāo)記，并對(duì)Ad2、Φ290噬菌體DNA 的末端蛋白 進(jìn)行了觀察。用鐵蛋白 標(biāo)記觀察到SV40的T抗原結(jié)合位點(diǎn)及SV40DNA 復(fù)制起始區(qū)。抗原-抗體反應(yīng)使DNA 結(jié)合蛋白 的信號(hào)特異性增強(qiáng)，單抗技術(shù)及電子致密物標(biāo)記抗體的問(wèn)世加速了此反應(yīng)在標(biāo)記技術(shù)中的應(yīng)用。此外，Wu及Davidson［24］建立了一種DNP-抗-DNP方法標(biāo)記DNA 結(jié)合蛋白 。首先，二硝基氟苯與DNA 結(jié)合的蛋白 反應(yīng)，二硝基苯酚(DNP)及抗原結(jié)合到蛋白 的氨基基團(tuán)，再與抗DNP抗體反應(yīng)，爾后結(jié)合鐵蛋白 或膠體金標(biāo)記的抗IgG；也可結(jié)合生物素化抗IgG或生物素化SPA，再與偶聯(lián)蛋白 或膠體金(鏈霉)親和素結(jié)合。此法對(duì)Ad2 DNA 末端蛋白 的標(biāo)記率可達(dá)78%。樣品可以用細(xì)胞色素C展層技術(shù)制備，并且經(jīng)過(guò)雙重標(biāo)記可以在電鏡下觀察到相對(duì)分子質(zhì)量小于6 000的蛋白 。
5 活性基因觀察
1969年Miller等［25］建立了染色體展層技術(shù)，爾后應(yīng)用于原核及真核系統(tǒng)核糖體基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的觀察［26］，首次在電鏡下觀察到真核活性轉(zhuǎn)錄基因的染色體結(jié)構(gòu)。首先從核仁中分離大部分核仁蛋白 ，獲得核仁染色體成分rDNA 染色質(zhì)，用于闡明前rRNA基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄單位的基本結(jié)構(gòu)排列。基因區(qū)在電鏡下為以DNA 為軸心的DNA -蛋白 細(xì)絲，被RNA聚合酶分子覆蓋，約有100多個(gè)同時(shí)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶顆粒。聚合酶顆粒在基因5′端(轉(zhuǎn)錄起始部位)及3′末端(轉(zhuǎn)錄終止部位)有明顯的界限。隨著轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，新生的互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)錄不斷延長(zhǎng)，并形成特定的構(gòu)象，在轉(zhuǎn)錄終止部位呈復(fù)雜的核糖核蛋白 (RNP)細(xì)絲結(jié)構(gòu)。因此，Miller染色體展層技術(shù)獲得了有關(guān)基因功能的重要的形態(tài)結(jié)構(gòu)資料。有關(guān)核仁分離及電鏡樣本制備技術(shù)及改進(jìn)，Trendelenburg等進(jìn)行了詳細(xì)描述。
電鏡下可觀察克隆的真核基因在異種系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)。將含有昆蟲(chóng)rRNA基因的環(huán)形DNA 注入蛙卵母細(xì)胞，展開(kāi)制樣后電鏡下有可能識(shí)別注入的DNA 上的起始轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行特異性分析；注入環(huán)狀DNA 有助于確定觀察到的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體是起源于注入的DNA 抑或是內(nèi)源性DNA 。腺粒體DNA 也能裝配成染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，那么它很有可能成為分析克隆的單拷貝基因轉(zhuǎn)錄活性、初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)及其加工的有力工具。
6 RNA∶DNA 雜交及R-環(huán)繪圖
RNA與DNA 分子內(nèi)的互補(bǔ)序列雜交包括兩種情況:一是RNA與完全變性的DNA 雜交，另一種是在近于DNA 的解鏈溫度(Tss)下與部分變性的DNA 互補(bǔ)序列雜交。在70%以上甲酰胺濃度條件下，RNA∶DNA 雜交體比DNA ∶DNA 雜交體更穩(wěn)定，DNA 復(fù)性后，RNA雜交處的序列不能復(fù)性而呈“眼”形R-環(huán)結(jié)構(gòu)。
該技術(shù)的應(yīng)用大致概括以下方面：顯示RNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域位置及長(zhǎng)度，確定轉(zhuǎn)錄方向。Roberts及Sharp應(yīng)用此技術(shù)在觀察Ad2 mRNA與其DNA 片段雜交分子時(shí)發(fā)現(xiàn)斷裂基因的存在，導(dǎo)gcft致全新的分子生物學(xué)觀點(diǎn)，并因此獲得1993年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在獲得cDNA 克隆后，可用此技術(shù)對(duì)相關(guān)病毒RNA進(jìn)行標(biāo)位。RNA∶DNA 雜交體可顯示多種RNA是否從相同或不同DNA 鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)；R-環(huán)技術(shù)也可對(duì)體外轉(zhuǎn)錄及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行分析。
7 蛋白 質(zhì)-DNA 相互作用
電鏡下可對(duì)結(jié)合于特異核苷酸序列的蛋白 進(jìn)行快速定位，而對(duì)蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)分析則較為困難，必須排除樣品制備過(guò)程產(chǎn)生的假象。制樣技術(shù)對(duì)條件變化非常敏感。蛋白 質(zhì)與DNA 的結(jié)合可以是特異性的，如酶及轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白 ；也可以是非特異性的，如組蛋白 等。蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體樣品常用BAC方法制備，由于標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，也可用細(xì)胞色素C技術(shù)進(jìn)行制樣。低溫電鏡技術(shù)則須用特殊的制樣方法。
首先各種酶與DNA 結(jié)合的研究，初期研究最多的是RNA聚合酶與噬菌體DNA 啟動(dòng)子部位。與轉(zhuǎn)錄繪圖方法相比，結(jié)合位點(diǎn)有許多不足，不能將激活轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)與其他結(jié)合位點(diǎn)區(qū)分開(kāi)。有些啟動(dòng)子位點(diǎn)能有效起始轉(zhuǎn)錄，但不形成穩(wěn)定的復(fù)合體；而強(qiáng)結(jié)合部位不一定能有效起始轉(zhuǎn)錄。最近利用低溫電鏡技術(shù)對(duì)RNA聚合酶與超卷曲DNA 分子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄中的作用進(jìn)行了研究，并與傳統(tǒng)電鏡方法進(jìn)行了比較。研究較多的另一種蛋白 是λ抑制子與操縱子DNA 的結(jié)合，可以觀察到抑制子四聚體的亞單位［27］。此外，在闡明限制性內(nèi)切酶與底物DNA 相互作用的復(fù)雜方式方面也做了大量工作。電鏡下直接觀察到λ及pML DNA 上的特異性限制酶切位點(diǎn)，加入ATP會(huì)使限制內(nèi)切酶發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化反映在酶的大小上，其直徑從1.6 nm降至于1.2 nm, 但不能確定這種變化的原因。EcoRⅠ是研究最多的內(nèi)切酶之一，其相對(duì)分子質(zhì)量為31 000，276個(gè)氨基酸，除與特異識(shí)別序列結(jié)合外，在鎂離子存在下也能發(fā)生非特異性結(jié)合，這種非特性結(jié)合可能有利于EcoRⅠ沿DNA 分子擴(kuò)散而形成特異性DNA -EcoRⅠ復(fù)合體［28］。近來(lái)對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA 結(jié)合的日益增多，Wong等用電鏡觀察到拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑可以使腺病毒雙鏈基因組在特定區(qū)域形成單鏈及雙鏈DNA 片段，并且在感染后期，腺病毒DNA 排列成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)緊密的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，證實(shí)在線性腺病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及包裝中拓?fù)洚悩?gòu)酶起重要作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA 相互作用受DNA 結(jié)構(gòu)的影響，它主要在DNA 彎曲-非彎曲連接處結(jié)合。利用電鏡還發(fā)現(xiàn)解旋酶的作用是在其結(jié)合鏈上以5′→3′方向進(jìn)行解鏈。
最近應(yīng)用電鏡技術(shù)研究較多的病毒DNA 結(jié)合蛋白 有SV40T抗原，EB病毒核心抗原(EBNA-1)，λ噬菌體0蛋白 ；另外對(duì)高動(dòng)族(HMG)蛋白 ［29］、RecA蛋白 ［30］等的電鏡研究日益增多。
制備蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體電鏡樣品時(shí)標(biāo)本的固定非常重要，一般用0.1%戊二醛固定。固定后的復(fù)合體比較穩(wěn)定，可以經(jīng)親和層析與未結(jié)合的蛋白 分離。Spiess等對(duì)核酸-蛋白 質(zhì)的制備及電鏡觀察有詳細(xì)描述。
8 結(jié)束語(yǔ)
DNA 電鏡技術(shù)自1959年Kleinschmidt等首次成功地觀察到雙鏈DNA 分子以來(lái)發(fā)展迅速，目前已經(jīng)建立了一系列方法［31］用于對(duì)基因排列進(jìn)行定量及定性分析。綜合運(yùn)用這些技術(shù)可以解決許多分子生物學(xué)中的問(wèn)題。標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及低溫電鏡技術(shù)的應(yīng)用，克服了傳統(tǒng)制樣技術(shù)中的某些缺陷，使DNA 電鏡技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛，大體可以概括如下：(1)觀察DNA 結(jié)構(gòu)特征；(2)觀察復(fù)制中間體等復(fù)雜結(jié)構(gòu)；(3)分析核酸分子之間的同源互補(bǔ)序列；(4)研究蛋白 質(zhì)-DNA 相互作用。
電鏡技術(shù)的基本優(yōu)點(diǎn)為：標(biāo)本用量小，制樣速度快，一般數(shù)小時(shí)內(nèi)即可獲得定量資料，提供關(guān)于DNA 的重要結(jié)構(gòu)域、基因組排列、蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合體特征的直接資料，彌補(bǔ)分子生物學(xué)研究方法的不足。
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