生物化學技術-生物大分子制備技術
生物大分子 ：蛋白質(包括酶)和核酸。
在當前迅速發展的現代生物學中，主要的研究方向就是以核酸和蛋白質的結構 與功能為基礎，從分子水平去認識生命現象。因此，得到高純度具有生物活性的目的物質成為一切研究的首位。
生物大分子的制備工作涉及物理、化學、生物等多學科知識。但總的來說就是：
1、 利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中。如：鹽析、層析、結晶和有機溶劑提取等。
2、將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同的區域而達到分離目的。如：電泳、梯度密度離心、超濾等。
注意：不管采取什么方法必須保持生物大分子的完整性和分子的生物活性。
生物大分子的制備步驟：
1、 選擇材料和預處理
2、 細胞破碎和細胞器 分離
3、 提取、純化與濃縮
4、干燥與保存
一、 選擇材料與預處理
微生 微生物材料：
1、利用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶
2、利用微生物體含有的生化物質：蛋白質、核酸和胞內酶等。
使用微生物作為提取材料時要注意它的生長期。因為，在它達到對數生長期時，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產量。
植物材料：利用材料的根、莖、葉、果實等部分提取其中的生物活性物質。
使用植物作為提取材料時要注意它的品種、生長地域、季節、氣候條件等，甚至采摘的時間段都要考慮。
動物材料：利用動物的臟器或組織提取有效成分。主要是選擇有效成分含量豐富的部分。動物材料一般要進行絞碎、脫脂等處理。
上述處理后的材料，若不立即進行試驗應冷凍保存!而對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。
二、細胞的破碎與細胞器的分離
(一) 細胞的破碎
1、 高速組織搗碎機
將材料配置成稀糊狀液，放置于搗碎杯內1/3體積，旋緊杯蓋。將調速器慢慢啟動逐漸調至所需轉速。或采用間歇方式進行。此方法適于動物內臟組織和植物肉質種子等。
2、 玻璃勻漿器
將剪碎的組織放入勻漿器管中，插入研杵來回研磨，利用管內和研杵的磨砂部分將組織細胞破碎。此方法適用于動物內臟和植物組織較嫩部分等。適合處理較少量的細胞破碎。其細胞破碎程度高于組織搗碎機。
3、超聲波處理法
使用一定功率的超聲波對細胞懸濁液進行處理，使細胞急劇震蕩破碎。此法多用于微生物材料，如用大腸桿菌制備各種酶。此方法的缺點在于處理材料時會產生大量的熱量，應注意降溫。而對于超聲波敏感的酶和核酸要慎用此法。
采用此法時選用菌體質量濃度為50—100mg/ml,在10—100KHZ下，處理10—15分鐘。
4、反復凍融法
將細胞在-20℃以下冰凍，室溫解凍。反復幾次。此時由于細胞內的水分形成冰粒和剩余細胞液的鹽濃度增加引起溶脹，使細胞結構破碎。常用于細菌的破壁和一些植物材料。
5、化學處理法
在細胞液中加入一定試劑，使其細胞膜破壞的方法。如：腫瘤細胞常采用加入SDS或去氧膽酸鈉等破壞細胞膜使胞內物釋放。細菌的細胞壁較厚常采用溶菌酶破壁。
(二)細胞器的分離
各類生物大分子在細胞內的分布不同。如：DNA幾乎全在細胞核內;RNA主要在細胞漿中。各種酶在細胞中也有特定的位置，因此，要根據目的物質的存在位置選取提取材料。
蛋白質、酶、核酸在肝細胞中的分布情況
細胞器名稱 主 要 蛋 白 質 及 酶 核 酸
細胞核
線粒體
內質網(微粒體)
溶酶體
高爾基體
細胞膜
細胞液 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系
參與電子傳遞、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、
TCA、氨基酸氧化的酶系及脲合成酶系
蛋白質合成酶系、羥化酶類
水解酶系
糖苷轉移酶、粘多糖、類固醇合成酶系
載體與受體蛋白、特異抗體、ATP酶、
環化脲苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶
嘧啶與嘌呤代謝酶系、氨基酸合成酶系、
可溶性蛋白類 全部DNA
總RNA的10%
微量DNA
總RNA的5-10%
總RNA的50%
總RNA的30%
(主要是tRNA)
細胞器的分離一般采用差速離心法。利用細胞各組分質量大小不同，沉降于離心管的不同區域，分離后得到所需組分。常用于分離細胞器的介質：蔗糖、氯化銫、葡萄糖、聚乙二醇等。
三、 提取與純化
提取——經過或破碎的細胞，置于一定條件的溶液中，使被提取的生物大分子充分釋放出來的過程。
影響提取的因素：被提取物質在提取溶液中溶解度的大小;由固相擴散到液相的難易程度。
物質在溶劑中溶解度大小與該物質的分子結構及溶劑的理化性質有關。一般遵守：“相似相溶”的原則。對提取生物大分子，減小溶劑粘度、攪拌和延長提取時間可提高擴散速度，提高提取效率。提取采用“少量多次”效果較好。
(一)蛋白質(酶)的提取
大部分蛋白質可溶于水、稀鹽、稀酸和稀堿溶液。少數與脂結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑。因此，要采取不同的溶劑提取、分離和純化蛋白質及酶。
1、水溶液
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質的穩定性好、溶解度高，是提取蛋白質的常用溶劑。
溶劑用量：一般為原材料體積的1—5倍;
提取溫度：視被提取物質的性質而定。(蛋白質溶解度隨溫度生高而增大，但溫度過高會使蛋白質變性失活。提取蛋白質和酶常采用低溫(5℃以下)操作;
提取條件：要均勻攪拌，加快擴散速度;
提取液的pH值：選擇偏離蛋白質或酶等電點兩側的pH值范圍;防止過酸或過堿引起蛋白質可解離基團發生變化，導致蛋白質構象的不可逆改變。一般堿性蛋白質使用偏酸性提取溶劑、酸性蛋白質使用偏堿性提取溶劑。
稀鹽提取液的濃度：稀鹽溶液可促進蛋白質的溶解，即鹽溶作用。同時，稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點。因此，在提取液中加入少量的NaCl等中性鹽一般以0.15mol•L-1濃度為宜。緩沖溶液常用0.02—0.05 mol•L-1磷酸鹽或碳酸鹽溶液。
2、有機溶液
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水，稀酸、稀堿和稀鹽溶液，可采用乙醇、丁醇或丙酮等有機溶劑提取。它們具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的脂蛋白提取液。但提取時一定要在低溫下進行。
丁醇對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越：丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強;它具有親水性，在溶解度范圍內不會引起酶的變性失活;此法溫度和pH值的選擇范圍廣，適用與所有的生物材料。
(二)蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化的方法很多，主要有：根據蛋白質的溶解度不同;根據蛋白質分子大小差別;根據蛋白質帶電情況;根據蛋白質配體的特異性差異等。
1、根據蛋白質溶解度不同的分離方法：
(1)蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著的影響。一般在低鹽濃度下隨鹽濃度的升高，蛋白質溶解度增加稱為鹽溶。隨鹽年度繼續增大時，蛋白質溶解度不同程度的下降并先后析出，這種現象稱為鹽析。
高濃度的鹽離子(如：(NH4)2SO4的SO4-2和NH4+)有很強的水化作用，可奪取蛋白質的水化層，使之“失水”，于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。
進行鹽析時，如溶液的pH值在蛋白質的等電點則效果更佳。
蛋白質分子的大小不同、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。因此，可通過調節蛋白質溶液的中性鹽濃度，使之分段沉淀。
血漿蛋白的分段鹽析
硫酸銨的飽和度 沉淀的主要蛋白質 占血漿總蛋白
g.(100mlH2O) 的質量分數，%
20 纖維蛋白 4
33—48 優球蛋白 3
40—46 假球蛋白 24
>50 清蛋白 69
影響鹽析的因素：
a、 溫度：除對溫度較敏感的蛋白質在低溫下(4℃)操作外，一般可在室溫下進行。
b、 pH值：大多數蛋白質在等電點的濃鹽溶液中溶解度最低。
c、 蛋白質濃度：一般蛋白質溶液含量掌握在25—30g•L-1。
蛋白質鹽析常用的中性鹽：
硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最廣的是硫酸銨。它具有溶解度的溫度系數小(25℃，4.1mol•L-1;0℃，3.9 mol•L-1)而溶解度大;分段鹽析比其它鹽效果好;不易引起蛋白質的變性。
硫酸銨溶液的pH值在4.5—5.5之間，當需要超出時，可用硫酸和氨水調節。
鹽析沉淀后的蛋白質要除去其中的鹽，常用透析(時間長，要低溫)和葡聚糖凝膠(G-25或G-50)層析柱來處理(時間短)。
(2)等電點沉淀法
蛋白質在電中性時，其靜電斥力最小，溶解度最小形成顆粒沉淀出來。由于各種蛋白質的等電點不同，可利用調節溶液的pH值達到某一蛋白質的等電點使之沉淀進行分離。此法多與鹽析法結合使用。
(3)低溫有機溶劑沉淀法
與水相溶的有機溶劑(甲醇、乙醇和丙酮等)可使多數蛋白質溶解度降低并析出。
此法分離效率比鹽析高，但蛋白質容易變性，應在低溫下進行。
2、根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
(1)透析與超濾
透析法是利用半透膜將大小不同的蛋白質分子分開。超濾法是利用高壓力或離心力，使水和其它小的溶質分子通過半透膜而蛋白質留在膜上。選擇不同孔徑的濾膜截留不同相對分子質量的蛋白質。
(2)凝膠過濾法(分子排阻層析法或分子篩層析)
這是根據分子大小分離蛋白質混合物的有效方法之一。主要填充材料是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠。
3、根據蛋白質帶電性質進行分離
根據蛋白質在不同的pH環境中帶電性質和電荷數量不同將其分開。
(1)電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因相對分子質量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同得以分開。
在電泳中等電聚焦電泳比較重要。它主要是利用一種兩性電解質作為載體。電泳時兩性電解質形成一個從正向負極逐漸增加的pH剃度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點pH位置就停止。
此法可用于分析和制備各種蛋白質。
(2)離子交換層析法
陽離子交換劑：羥甲基纖維素;陰離子交換劑：二乙氨基乙基纖維素。
當被分離蛋白質溶液流經陽離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，然后用改變pH或離子強度的方法將吸附的蛋白質從柱上洗脫下來。
4、根據配體特異性的分離方法—親和層析法
親和層析法是分離蛋白質的一種非常有效的方法。它通常需要一步處理即可使某種待提純分離的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來。而且純度很高。
此法根據某些蛋白質與另一種稱為配體的分子能特異而非共價地結合。如：酶—輔酶、抗原—抗體、激素—受體等。其原理：先把待提純的目的蛋白的配體共價連接到瓊脂灘一類的多糖表面的功能團上，當混合蛋白流經層析柱時，待提純的蛋白與特異的配體結合而吸附在層析柱上，其他雜蛋白流出，最后將與配體結合的特異蛋白洗脫下來。
蛋白質在組織和細胞中是以復雜的混合形式存在。每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離、提純和鑒定是生物化學中的重要部分。至今還未有一種單獨或一套現成方法可把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來。往往需要幾種方法的聯合使用。
(三)核酸的提取
核酸都溶于水，不溶于有機溶劑。因此，利用此性質進行提取。在細胞中，DNA以DNP、RNA以RNP形式存在，在不同濃度的鹽溶液中它們的溶解度差別很大。如：DNP在純水或1 mol•L-1NaCl中溶解度較大，但在0.14 mol•L-1NaCl中溶解度很低。相反，RNP卻易溶解。因此，利用0.14 mol•L-1NaCl溶液可以簡單的將DNP與RNP分開。
分離核酸時最困難的是將核酸與緊密結合的蛋白質分開，而且還要避免核酸降解。
常用的解離劑是陰離子去污劑：脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、4-氨基水楊酸鈉和萘-1，5二磺酸鈉。它們具有溶解病毒、細菌的作用，可使核酸從蛋白質上游離出來。并且還具有抑制核糖核酸酶的作用。
除去核酸中蛋白質的有效方法是用酚—氯仿混合液，它可使蛋白質變性并對核酸酶有抑制作用，氯仿的比重大可使有機相與水相完全分開減少在水相中的酚。
操作時需要劇烈震蕩。
為防止起泡和促使水相與有機相分離，可在酚—氯仿抽提液中加入一定量的異戊醇。
組織細胞破碎后，加入0.5mol•L-1NaCl溶液，離心去上請液→沉淀用1.0mol•L-1NaCl溶液溶解→用酚—氯仿混合液震蕩抽提→離心，取水相→加入2倍體積的乙醇沉淀DNA。
在提取DNA的溶液中加入EDTA(乙二胺四乙酸)金屬螯合劑，以除去Ca+2、Mg+2，抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，減少對DNA的降解。而DNA中少量的RNA可用純核糖核酸酶(RNase)水解除去。
2、RNA的提取
提取中的關鍵在于防止RNase的降解作用。許多試劑中和手指上都有此酶，所以要特別注意。一般常用：a、低溫操作(4℃)b、所用器械、器皿高溫消毒，試劑中加入RNase抑制劑c、操作時帶手套。
細胞中含有mRNA、tRNA、rRNA不易分離。可將細胞勻漿液進行差速離心，得到細胞核、線粒體和核糖體等，然后再從這些細胞器中分離某一類RNA。
(四)核酸的純化
核酸純化的關鍵步驟是除去蛋白質。通常只要用酚—氯仿、氯仿提取核酸水溶液即可。
用酚—氯仿混合液比單獨用酚除蛋白效果更佳。然后再用氯仿抽提可除去核酸制品中的痕量酚。
步驟：1、核酸樣品置于有蓋小離心管中，加入等體積酚—氯仿→2、旋渦混勻管內物，呈乳狀→3、12000g，室溫離心15S→4、水相移入另一離心管中，棄去兩相界面和有機相→5、重復上述步驟直至兩相界面無蛋白質→6、加入等體積氯仿并重復2—4步驟→7、濃縮、沉淀，回收核酸。
(五)核酸的濃縮
應用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后可形成的核酸沉淀可經離心回收。此法對Pg(皮克，10-12g)量的DNA或RNA，也可定量回收。再按所需濃度溶于適當緩沖溶液中。
操作步驟：先向含有樣品的小離心管中加入V/10的單價陽離子貯存液，2V無水乙醇，混勻。放入冰水浴中15—30min，取出后目測平衡，0—4℃，12000g離心10min。棄上清。加入70%乙醇溶液0.5—1ml，0—4℃，12000g離心2min。棄上清，沉淀用油泵抽干或打開離心管蓋子涼干，溶于適當體積緩沖液。
(六)DNA、RNA的定量
準確的方法是紫外分光光度法。但此法要求核酸樣品純凈，其中不應含有蛋白質、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物。
用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩處的吸光度值。然后按1A260相當于50ug•ml-1雙鏈DNA;40 ug•ml-1單鏈DNA或RNA;20 ug•ml-1單鏈寡核苷酸計算樣品核酸含量。A260/ A280反映樣品核酸的純度。DNA純品其比值為1.8，RNA純品比值為2.0。樣品中含有蛋白質或酚污染，其比值低于此數。
(七)核酸的凝膠電泳和相對分子量參照物
1、 瓊脂糖凝膠電泳
常用于分離、鑒定、提純DNA片段。
本方法操作簡單、迅速 能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物。分開的DNA片段可用低質量的的熒光染料(0.5 ug•ml-1溴化乙錠)染色，在紫外燈下直接觀察。可檢測少到1ng的DNA。
DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于：a、DNA分子大小;線狀DNA分子通過凝膠的速率與其相對分子質量的常用對數成反比。利用已知相對分子質量的標準物質與待測相對分子質量的DNA片段同時電泳，比較其電泳速率，即可求出其分子大小。b、瓊脂糖濃度：利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛、大小不同的DNA片段。
不同質量濃度可分離線狀DNA分子的范圍
瓊脂糖凝膠質量范圍 分離線狀DNA分子的范圍
g•L-1 Kb
3 5—60
6 1—20
7 0.8—10
9 0.5—7
12 0.4—6
15 0.2—3
20 0.1—2
C、DNA的構型：相同相對分子質量的閉環(Ⅰ型)、開環(Ⅱ型)和線形(Ⅲ型)DNA，以不同速率通過凝膠，一般情況下其遷移率：Ⅰ型〉Ⅲ型〉Ⅱ型。d、應用的電壓：在低電壓時，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成反比。在電壓增加時，相對分子質量大的DNA片段遷移率增大不同。因此，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨率，電泳時，電壓不應超過5V•cm-1。
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
此法適用于分析和制備小于1Kb長度的DNA片段。
有效分離范圍
凝膠質量濃度g•L-1 有效分離范圍 bp
35 100—1000
50 80—500
80 60—400
120 40—200
200 10—100
聚丙烯酰胺凝膠電泳多用于垂直板電泳和圓盤電泳。
不同濃度聚丙烯酰胺凝膠配置表
試 不同質量濃度g•L-1凝膠所用試劑ml數
劑 35 50 80 120 200
30%單體母液 11.6 16.6 26.6 40 66.6
H2O 76.3 71.3 61.3 47.9 21.3
3%過硫酸銨 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1
10×TBE 10 10 10 10 10
總體積 100 100 100 100 100
30%單體母液：29g丙烯酰胺，1g雙丙烯酰胺加水溶解，定容到100ml。
10×TBE：每升含Tris(二羥甲基氨基甲烷)108g;硼酸55 g和EDTA(乙二胺四乙酸)
40ml，0.5mol•L-1(pH 8.0)
總體積可根據各組分比例按具體使用情況配置。
具體步驟：將上述配置的液體100ml加入30ul四甲基乙二胺(TEMED)混勻后，可灌注預先準備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板。待凝膠灌至頂端時，立即插入“梳子”，室溫聚合60min(冬季室穩較低可放入37℃溫箱中)，聚合完成后拔出“梳子”，將膠板固定于電泳槽中，加入1×TBE，用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部除去氣泡，即可加樣電泳。圓盤電泳則將凝膠灌入玻璃管。一般所用電壓為1—8•cm-1，隨時觀察標記染料(1%溴酚藍)的遷移。電泳結束，從電泳槽上取出玻板并小心撬開，凝膠片浸于溴化乙錠液 (0.5ug•ml-1的1×TBE溶液)染色45min后，于紫外燈下觀察結果。
3、相對分子質量參照物
為判斷目的DNA片段的大小，常在目的DNA的旁邊加一相對分子質量參照物，同時電泳并染色后，就能在紫外燈下很快知道目的DNA片段的大小。常用參照物：λHindⅢ消化物，其各片段大小(bp)：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。
四、濃縮、干燥及保存
(一)樣品濃縮
生物大分子溶液在制備過程中由于過柱純化時變的很稀，為了保存和鑒定的目的，需要進行濃縮。
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低。減壓的真空度愈高液體沸點愈低，蒸發愈快。此法適合不耐熱的生物大分子濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣流動可使液體加速蒸發。將鋪成薄膜的液體表面不斷通過空氣流。或將樣品溶液裝入透析袋，置于冷室，用電扇對準吹風，使透析膜外溶劑不斷蒸發達到濃縮目的。此法濃縮速度慢，不適于大量溶液處理。
3、冰凍法
生物大分子溶液在低溫下結成冰, 鹽類和生物大分子不能進入冰內而留在未結冰的液相中。操作時，先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢融解，利用溶劑與溶質融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如：蛋白質或酶的鹽溶液濃縮。
4、吸收法
通過吸收劑直接吸收除去溶劑分子使之濃縮。此法要求吸收劑與溶劑不起化學反應，對生物大分子不吸附，并吸收劑與溶液移分開。常用的吸收劑：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。
5、超濾法
使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性的過濾。當溶液在一定壓力下(氮氣加壓或真空負壓)通過膜，溶劑和小分子透過而大分子受阻保留。此法是近年發展的新方法應用較廣，對蛋白質和酶溶液的濃縮、脫鹽具有成本低、操作方便、條件溫和、較好的保持生物大分子活性及回收率高等優點。
(二)干燥
真空干燥：適用于不耐高溫、易于氧化物質的干燥和保存。裝置包括：干燥器、冷凝器和真空泵。干燥劑常用：P2O5、CaCl(無水)、變色硅膠等。
冷凍干燥：除利用真空原理外，還增加溫度因素。此法是在低溫低壓下使冰升華變成氣體而除去。產品具有疏松、溶解度好和保持天然結構等優點。
(三)保存
生物大分子的穩定性與保存方法有很大關系。干燥制品一般比較穩定。在低溫情況下其活性可在數月甚至數年無明顯變化。貯藏要求簡單，只將樣品于干燥器內(加干燥劑)密封，保存在0—4℃冰箱中即可。
液氮貯藏可免除繁雜的干燥過程，且生物大分子的活性和結構不易破壞。
進行保存要注意：
1、樣品溶液不能太稀，太稀易變性。必須濃縮到一定程度才可封裝貯藏。
2、一般要加入防腐劑和穩定劑。防腐劑：甲苯、苯甲酸、氯仿、白里酚等。穩定劑：硫酸銨糊、蔗糖、甘油等。核酸一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。
3、貯存溫度要低。大多數在0℃左右的冰箱中。有的要求更低的溫度。，視情況而定。
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