FISH技術(shù)在白血病中的應(yīng)用
熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, 簡稱FISH)由于其直觀, 快速, 敏感性高和方便靈活越來越得到廣泛應(yīng)用, 尤其是在血液學(xué)領(lǐng)域中. 因?yàn)榘籽?biāo)本比較容易取得和制備, 不同類型的白血病又往往有其特異的染色體異常, FISH在白血病診斷, 治療監(jiān)測, 預(yù)后估計和微小殘留病檢測等諸方面都正成為不可缺少的重要手段.
FIHS技術(shù)本身也在新的需求下不斷更新和完善.FISH的基本原理很簡單, 就是標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的DNA(玻片上的標(biāo)本)退火雜交, 通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況.
FISH探針按標(biāo)記方法可分為直接標(biāo)記和間接標(biāo)記: 用 生物 素(biotin)或地高辛(digoxingenin)標(biāo)記稱為間接標(biāo)記, 雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號, 因而 步驟較多, 操作麻煩, 其優(yōu)點(diǎn)是在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大; 直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記. 由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號, 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng), 不再需要購買熒光抗 體, 也由于近年來熒光互的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高, 直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選, 如Vysis公司 的FISH探針均采用直接熒光標(biāo)記, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標(biāo)本上同時檢測多鐘異常. 其熒光強(qiáng)度 和信號大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 操作過程中也不需要嚴(yán)格避光, 使FISH過程變得簡便而易于操作. FISH并不能取代傳統(tǒng)的白血病MCI診斷, 但它卻能使MIC分型更為準(zhǔn)確和深入. 我們知道, MIC即細(xì)胞形態(tài) 學(xué)(M), 免疫學(xué)(I)和細(xì)胞遺傳學(xué)(C), 三者結(jié)合對白血病進(jìn)行分型診斷, 對不同類型的白血病采用不同治療方案手段. 隨著人們對白血病的不斷認(rèn)識, 僅進(jìn)行MIC分型已不夠全面, 還要加上對白血病的分子(M)診斷, 成為MICM分型. FISH就是連接細(xì)胞遺傳學(xué)和分子 生物 學(xué)的橋梁.
白血病檢測中常用的FISH探針有單一序列探針, 著絲粒探針, 整條染色體探針, 常用方法有單標(biāo)記FISH, 雙 標(biāo)記FISH, 比較基因組雜交(CGH), M-FISH 和Rx-FISH等. 各種FISH探針及方法均在白血病的診斷, 治療監(jiān)測, 預(yù)后估計和微小殘留病檢測中起重要作用:
1. 白血病診斷.
白血病的細(xì)胞遺傳學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多白血病特異的染色體易位, 為疾病的診斷和特異治療提供了依據(jù). 目前, 大部分易位累及的白血病相關(guān)基因已經(jīng)被克隆, 可通過檢測些融合基因?qū)Π籽∵M(jìn)行分子診斷. 常見的單一序列探 針有PML-RAR?[t(15;17), 見于M3, AML1-ETO[t(8;21), 見于M2b], BCR-ABL[t(9;22), 見于CML和ALL], TEL- AML1[t(12;21), 見于兒童前B-ALL]等等, 為方便起見, 商品化的探針多為標(biāo)記的, 即兩個基因分別用兩種顏色標(biāo)記, 同時在一張玻片標(biāo)本上雜交. 用FISH進(jìn)行融合基因檢測比常規(guī)的染色體核型分析要準(zhǔn)確, 其敏感性雖略低于RT- PCR方法, 但其假陽性和假陰性率卻大大低于PCR法. 若核型分析, RT-PCR, FISH三者結(jié)合則可大大提高白血病診 斷的準(zhǔn)確性.
常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析常有一些染色體易位不易發(fā)現(xiàn)或有不明來源的標(biāo)志染色體或有復(fù)雜的染色體易位不易診 斷. FISH則可解決這些難題. 白血病的染色體異常分為染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常. 對數(shù)目異常, 可采用染色體著 絲粒探針或整條染色體探針[又稱為染色體涂色(Chromosome painting, CP)探針]. 如慢性粒細(xì)胞性白血病急變時常常 出現(xiàn)8號染色體三體. 此時8號著絲粒探針或CP探針就很容易診斷了. 目前, 幾乎所有染色體均已有了商品化的著 絲粒和CP探針. CP探針也適用于標(biāo)志染色體和不易發(fā)現(xiàn)或復(fù)雜的染色體易位的檢測, t(12;21)的發(fā)現(xiàn)就是最好的例子. 染色體涂色往往要在核型分析的基礎(chǔ)上, 選擇可能發(fā)生異常染色體探針做雜交, 如果三條以上染色體發(fā)生復(fù)雜的交互 易位, 需要多次雜交分析才能確定.
為解決這一問題, 在染色體涂色的基礎(chǔ)上開發(fā)了M-FISH技術(shù). M-FISH相當(dāng)于在 一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色, 因而很容易就可看到多條染色體間的復(fù)雜易位情況和確定標(biāo)志染 色體的來源. M-FISH因其這一優(yōu)點(diǎn)正成為分子遺傳學(xué)家手中重要工具, 然而, 對同一條染色體中的易位或倒位它就 無能為力了, 而且, 它也不能精確地顯示染色體斷裂的區(qū)帶. 能否讓每條區(qū)帶也雜交上不同的顏色呢? 這一想法導(dǎo) 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的誕生. 它幾乎解決了上述所有的問題, 然而Rx-FISH探針價格不菲, 目前已有多家公 司正在開發(fā)和改進(jìn)中. 不論是哪一種FISH, 其成功與否都與染色體標(biāo)本的質(zhì)量密切相關(guān), M-FISH和Rx-FISH的要求 尤其較高.
除了M-FISH和Rx-FISH外, 在血液病研究中使用較多的一種FISH相關(guān)技術(shù)是比較基因組雜交(Comparative Genomic Hybridization, CGH). CGH與上述的各種方法有所不同, 它不需要制備患者的染色體標(biāo)本, 只需抽提腫瘤 組織和正常組織的基因組DNA, 分別標(biāo)記后作為探針與正常人染色體雜交即可, 因而CGH最適合于檢測實(shí)體瘤, 淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病. CGH另一無法替代的優(yōu)點(diǎn)是, 它可在一次雜交中檢測整個基因遺傳 物質(zhì)的增加或減少, 但精度有限, 對微小的擴(kuò)增或缺失檢測不出, 僅適用于對整個基因組進(jìn)行篩查. CGH也無法發(fā) 現(xiàn)平衡染色體易位.
從以上介紹可以看出: 各種FISH技術(shù)為白血病診斷提供了多樣的手段, 各種方法有其特定的適用范圍, 應(yīng)根據(jù) 需要結(jié)合使用.
2. 預(yù)后估計, 治療監(jiān)測和微小殘留病檢測;
白血病的預(yù)后估計, 治療監(jiān)測和微小殘留病檢測都基于某種類型白血病特異的染色體或基因改變, 如對M3病 人首先檢測是否伴有t(15;17)/ PML-RARA或t(11;17)/PLZF/RARA, 如果有PML-RARA 融合基因則用全反式維甲酸 治療預(yù)后好, 而伴有PLZF/RARA則預(yù)后較差且需選擇其它治療方案. 初發(fā)時檢測出的異常可作為治療監(jiān)測和隨訪 過程中檢測微小殘留病變的有效指標(biāo), 進(jìn)行跟蹤監(jiān)測. 在疾病初發(fā)和每次開始治療前檢測有否分子遺傳學(xué)異常非常 重要.
目前, 檢測手段主要依靠RT-PCR, 因?yàn)槠涿舾行愿吆鸵子陂_展, 但也常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題, 影響了其準(zhǔn) 確性, 并且無法量化. 近年來, 實(shí)時PCR很好地解決了量化的問題, 其缺點(diǎn)是成本較高, 探針種類有限, 目前僅能檢測 PML-RARA和AML1-ETO融合基因. 另一在國際上更為廣泛應(yīng)用的方法是間期FISH. 間期FISH由于不需制備染色體 標(biāo)本, 節(jié)省了大量時間, 又由于商品化探針質(zhì)量可靠, 操作步驟簡單而達(dá)到快速, 簡便的要求. 間期FISH還具有可量 化和假陽性, 假陰性率低的優(yōu)點(diǎn), 且其敏感性僅比PCR方法略低, 完全符合臨床診斷的需要, 應(yīng)用不同顏色的熒光探 針還可同時檢測多個基因異常.
綜上所述, FISH在血液病中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛, 但在我國的血液病臨床上應(yīng)用還不多. 由于FISH具有直觀, 敏感, 方便, 可量化和方法多樣, 適應(yīng)不同檢測的目的等優(yōu)點(diǎn), 隨著FISH技術(shù)的發(fā)展, 成本的降低和探針種類和質(zhì)量的進(jìn) 一步提高, FISH必將成為血液病臨床及基礎(chǔ)研究的重要手段.
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